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Definire la distribuzione subcellulare di complessi di segnalazione è fondamentale per comprendere l'output di quel complesso. Metodi convenzionali come immunoprecipitazione non forniscono informazioni sulla localizzazione spaziale dei complessi. Al contrario, BiFC controlla l'interazione e la compartimentazione subcellulare di complessi proteici. In questo metodo, una proteina fluororescent è suddivisa in amino-e carbossi-terminale non fluorescente frammenti che vengono poi fuse per due proteine di interesse. Interazione dei risultati proteine ricostituzione del fluoroforo (Figura 1) 1,2. Una limitazione di BiFC è che una volta che il fluoroforo frammentato è ricostituito il complesso è irreversibile 3. Questa limitazione è vantaggioso nel rilevare interazioni transitoria o deboli, ma esclude l'analisi cinetica di dinamiche complesse. Un ulteriore avvertimento è che il flourophore ricostituito richiede 30 minuti di maturare e di fluorescenza, di nuovo precludendo l'osservazione di interazioni in tempo reale 4. BiFC è un esempio specifico del test di complementazione proteica frammento (PCA), che impiega proteine giornalista come varianti proteina fluorescente verde (BiFC), la diidrofolato reduttasi, b-lattamasi, e luciferasi per misurare le proteine: interazioni proteina 5,6. Metodi alternativi per lo studio delle proteine: interazioni proteina nelle cellule includono fluorescenza co-localizzazione e Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) 7. Per la co-localizzazione, due proteine sono contrassegnati individualmente o direttamente con un fluoroforo o mediante immunofluorescenza indiretta. Tuttavia, questo approccio porta a di fondo di non interagenti proteine che lo rende difficile da interpretare co-localizzazione dei dati. Inoltre, a causa dei limiti di risoluzione della microscopia confocale, due proteine possono apparire co-localizzati senza necessariamente interagire. Con BiFC, fluorescenza è osservato solo quando le due proteine di interesse interagire. FRET è un altro ottimo metodo per lo studio delle proteine: interazioni delle proteine, ma possono essere tecnicamente difficile. FRET esperimenti richiedono il donatore e accettore di essere di luminosità simili e stechiometria nella cella. Inoltre, si deve tenere conto di sanguinare tramite del donatore nel canale accettore e viceversa. A differenza di FRET, BiFC ha poco fluorescenza di fondo, poco dopo l'elaborazione dei dati di immagine, non richiede l'iperespressione alto, e in grado di rilevare le interazioni deboli o transitorie. Risonanza trasferimento bioluminescenza energia (BRET) è un metodo simile a FRET tranne il donatore è un enzima (luciferasi ad esempio) che catalizza un substrato per diventare bioluminescenti così emozionante un accettore. BRET mancano i problemi tecnici di sanguinare attraverso e fluorescenza di fondo alto, ma manca la capacità di fornire informazioni spaziali a causa della mancanza di localizzazione del substrato ai compartimenti specifici 8. Nel complesso, BiFC è un metodo eccellente per la visualizzazione di localizzazione subcellulare di complessi proteici al fine di conoscere segnalazione compartimenti stagni.