Un β-glucuronidasi (GUS) Sulla base di analisi morte cellulare

Summary

Morte cellulare programmata test comunemente usati nei sistemi di mammiferi, come laddering DNA o saggi TUNEL, sono spesso difficili da riprodurre nelle piante. In combinazione con un sistema di giornalista GUS, proponiamo un rapido test basato impianti transitori per analizzare le proprietà morte potenziale di specifici geni.

Abstract

Abbiamo sviluppato un nuovo sistema di espressione transiente pianta che esprime allo stesso tempo il gene reporter β-glucuronidasi (GUS), con putativi regolatori positivi o negativi di morte cellulare. In questo sistema, N. lascia benthamiana sono co-infiltrati con una cassetta 35S espressione guidato contenente il gene da analizzare, e il GUS vettore pCAMBIA 2301 utilizzando LBA4404 ceppo Agrobacterium come veicolo. Poiché le cellule vive sono necessari per l'espressione GUS a verificarsi, perdita di attività GUS è previsto quando questo gene marcatore è co-espresso con regolatori positivi di morte cellulare. Allo stesso modo, un aumento dell'attività GUS si osserva quando i geni anti-apoptotici vengono utilizzati rispetto al controllo vettoriale. Come mostrato di seguito, abbiamo utilizzato con successo questo sistema nel nostro laboratorio per analizzare entrambi i giocatori pro-e anti-morte. Questi includono l'impianto anti-apoptotica Bcl-2 associati athanoGene (UFSP), la famiglia, così come, gli induttori conosciuti mammiferi di morte cellulare, come BAX. Inoltre, abbiamo utilizzato questo sistema per analizzare la funzione morte di troncamenti specifiche all'interno di proteine, che potrebbe fornire indizi sulla possibile modificazione post-traduzionale / attivazione di queste proteine. Qui, vi presentiamo un metodo rapido e sensibile impianto base, come un primo passo nello studio delle funzioni morte di specifici geni.

Protocol

Nicotiana benthamiana piante sono coltivate in una temperatura controllata camera di crescita a 25 ° C. Completamente ampliato foglie sane di 3-6 piante settimana di vita sono utilizzati.

Suggerimento: I risultati migliori si ottengono utilizzando le foglie emergenti

1. Agrobacterium protocollo di infiltrazione transitoria:

Giorno 1

1. LB Streak / rifampicina (25 mg / ml) / kanamicina (100 mg / ml) piastre di agar con gli stock di glicerolo di Agrobacterium tumefaciens (ceppo LBA4404) contenente i vettori appropriato con il gene (s) per essere analizzati per la morte ....

Discussion

E 'spesso difficile da usare tecniche di individuazione delle cellule morte in impianti che sono comuni nei sistemi di mammiferi. In combinazione con un sistema di giornalista GUS, presentiamo una base vegetale, metodo sensibile per la rilevazione e l'analisi di giocatori di morte cellulare. Questo metodo sfrutta il semplice fatto che le cellule vive sono necessari per l'espressione GUS a verificarsi. Per garantire risultati significativi e la ripetibilità, è fondamentale che le culture ospitare la casset.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Rifampicina	VWR	IC19549001	Magazzino 25mg/ml in DMSO
4'-idrossi-3 ', 5'-dimethoxyacetophenone (Acetosyringone)	VWR	TCD2666	0,981 g / mL in DMSO (1M stock)
2 - (4-morfolino) etano monoidrato (MES)	VWR	EM-6110	1,92 g / L in acqua per fare 1 litro di media infiltrazione
Bacto-triptone	Pescatore	BP1421-2	10 g / L in acqua per fare 1 l di media LB
Bacto-estratto di lievito	VWR	EM1.03753.0500	5 g / L in acqua per fare 1 l di media LB
Cloruro di sodio	VWR	EM-7710	10 g / L in acqua per fare 1 l di media LB
Sodio fosfato monobasico monoidrato	VWR	MK-7868-12	2.5g / L in acqua per fare 50 mM di tampone Napi
Sodio fosfato bibasico eptaidrato	VWR	EMD-SX0715-1	5 g / L in acqua per fare 50 mM di tampone Napi
Solfato di magnesio eptaidrato	VWR	EM-MX0070-1	2,5 g / L in acqua per fare 1 litro di media infiltrazione
N-Lauroylsarcosine	VWR	TCL0151-500G	0,1% v / v in tampone GUS
5-Bromo-4-cloro-3-indossile-beta-D-glucuronide sale cyclohexylammonium (X-Gluc)	Oro Biotecnologie	G1281C	1mg/100uL in metanolo 100%
4-metilumbelliferil-μ-D-glucuronide idrato (MUG)	Sigma	M5664	2 mM in 100 uL di tampone di estrazione GUS
Ferrocianuro di potassio triidrato	VWR	EM-PX1460-1	Magazzino 100mM per X-Gluc soluzione substrato
β-Methylumbelliferone (MU)	Sigma-Aldrich	M1381	Per MU standard di utilizzo del buffer di estrazione curva GUS
Carbonato di sodio	VWR	EM-SX0395-11	0,2 M in acqua per fare GUS tampone arresto