PGS elastomerico Ponteggi in Ingegneria tessuto arterioso

Sommario

PGS elastomerico ponteggi con cellule muscolari lisce vascolari in coltura in un bioreattore flusso pulsatile può portare a promettenti costruisce arterie di piccolo diametro con la produzione ECM nativo in un relativamente breve periodo di coltura.

Abstract

Le malattie cardiovascolari sono una delle principali cause di mortalità negli Stati Uniti e soprattutto, malattia coronarica aumenta con l'invecchiamento della popolazione e l'aumento dell'obesità ^1. Attualmente, la chirurgia di bypass utilizzando vasi autologhi, trapianti e innesti sintetici sono conosciuto come un comunemente usato per i sostituti arteriosa ^2. Tuttavia, questi innesti hanno applicazioni limitate quando un diametro interno delle arterie è inferiore a 6 mm a causa della scarsa disponibilità, complicanze trombotiche, mancata corrispondenza rispetto, e alla fine iperplasia intimale ^3,4. Per superare queste limitazioni, l'ingegneria dei tessuti è stata applicata con successo come alternativa promettente per sviluppare costruisce arterie di piccolo diametro che sono nonthrombogenic, robusti e conformi. Diversi studi precedenti hanno sviluppato costruisce arteriosi di piccolo diametro con tri-struttura lamellare, eccellenti proprietà meccaniche e la pressione di scoppio paragonabile ad arterie native ^5,6. Mentre elevata resistenza alla trazione e pressione di scoppio, aumentando la produzione di collagene da un materiale rigido o cella foglio patibolo, questi costrutti ancora bassa produzione di elastina e di conformità, che è un grosso problema per causare il fallimento dell'innesto dopo l'impianto. Considerando questi aspetti, abbiamo ipotizzato che un elastomero biomateriale combinato con condizionamento meccanico fornirà elasticità e condurre segnali meccanici in modo più efficiente alle cellule vascolari, che aumentano la produzione della matrice extracellulare e supporto all'orientamento cellulare.

L'obiettivo della presente relazione è quello di introdurre una tecnica di fabbricazione di poroso ponteggi tubolari e un condizionamento meccanico dinamica di applicazione a ingegneria dei tessuti delle arterie. Abbiamo usato un elastomero biodegradabile, poli (sebacato glicerolo) (PGS) ⁷ per la realizzazione di ponteggi tubolari poroso dal metodo di fusione del sale. Adulto primaria cellule muscolari lisce babbuino (SMC) sono stati seminati sul lume di ponteggi, che colta nel nostro bioreattore progettato flusso pulsatile per 3 settimane. Ponteggi PGS aveva spessore costante e distribuiti in modo casuale macro e micro-pori. Condizionamento meccanico da bioreattore flusso pulsatile supportato SMC orientamento e una maggiore produzione di ECM in ponteggi. Questi risultati suggeriscono che i ponteggi elastomerici e condizionamento meccanico della cultura bioreattore può essere un metodo promettente per l'ingegneria tissutale arteriosa.

Protocollo

1. Ponteggio tubolare di fabbricazione

1. Preparare tubo di vetro (lunghezza = 70 mm, diametro esterno = 9,0 mm, spessore parete = 1,0 mm; parti piccole, Miramar, FL) come stampo per ponteggio.
2. Preparare 1,0 peso / volume% acido ialuronico (HA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), sciogliendo 100 mg di HA in 10 ml di acqua deionizzata. Mescolare con un rotore durante la notte fino a quando non vi siano bolle d'aria in soluzione.
3. Versare la soluzione HA 1,0% nella parte superiore del tubo di vetro. Lasciarla fluire lentamente lungo la parete interna dello stampo. Capovolgere il tubo quando la soluzione raggiunto il fondo dello stampo con il rotore e ripetere l'operazione fino a quando la parete interna dello stampo è uniformemente rivestito dalla soluzione.
4. Dopo il rivestimento, asciugare tutte le tubazioni di vetro nel forno a vuoto a 37 ° C per 24 h.
5. Grind e particelle di sale setaccio (size = 25-32 micron), utilizzato come porogens.
6. Assemblare un tubo di vetro (interno rivestito con una soluzione di HA 1,0%), anima (in acciaio inox rivestito da tubi in PTFE), termoretraibili (HS) manica, e l'anello in PTFE come descritto in precedenza ^8.
7. Aggiungi particelle sale della dimensione desiderata per lo stampo di vetro con una spatola attraverso l'imbuto in gomma siliconica. Toccare delicatamente lo stampo per garantire un'equa distribuzione delle particelle di sale. Raschiare le particelle di sale in eccesso nella parte superiore dello stampo usando il lato della spatola.
8. Accendere l'ibridazione incubatore per 30 minuti prima di trasferire il sale ricco di muffa. Spegnere l'ibridazione incubatore e mettere il sale ricco di muffa nel ibridazione incubatore per la fusione di sale.
9. Togliere gli stampini dal ibridazione incubatore e asciugarli nel forno a vuoto a 37 ° C per 24 h.
10. Togliere il sale ricco di stampi da forno vuoto e lasciare raffreddare a temperatura ambiente. Rimuovere il mandrino in acciaio inox, spingendolo verso il basso con tenendo l'anello in PTFE. Se il mandrino è troppo stretto per lo stampo, utilizzare le pinze ad ago per tirarlo fuori. Rimuovere l'anello di PTFE dal fondo dello stampo.
11. Mettere gli stampi in forno a 120 ° C per 5 minuti a ridursi manica HS. Controllare se il manicotto HS si restringe. Rimuovere la copertura di SA dal sale ricco di stampi e lasciare raffreddare a temperatura ambiente. Tenere gli stampi in essiccatore fino a quando non vengono utilizzati.
12. Preparare la soluzione PGS sciogliendo 3 g di PGS in 15 ml di tetraidrofurano (THF) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) per formare un 20 wt / soluzione% vol.
13. Aggiungere la soluzione PGS al lume di sale ricco di stampi facendola cadere con un spoid nel cappuccio Hume. Magra lo stampo di vetro di circa 45 ° e rilasciare la soluzione PGS in lume interno con rotazione dello stampo lentamente. Controllare se la soluzione PGS scende lungo la parete di muffa. Se la macchia secca è osservato, aggiungere altre soluzioni.
14. Dopo aver aggiunto la soluzione PGS, luogo gli stampi nel cofano Hume per almeno 30 minuti per l'evaporazione THF.
15. Mettere gli stampi in forno a vuoto per la pre-determinato tempo di maturazione (es. 24 / 36 / 48 h) a 100 mTorr e 150 ° C per PGS stagionatura.
16. Dopo la polimerizzazione, togliere gli stampini e metterli a temperatura ambiente per raffreddare. Immergere ogni stampo in acqua deionizzata con posizione verticale lentamente. Non immergerli in acqua perché il digiuno bolle d'aria possono causare strappi al patibolo.
17. Trasferire gli stampi a bagnomaria con cura e metterli in un angolo per 1 h con tubo in silicone per sciogliere HA facilmente. Controllare se HA è sciolta dallo stampo. Se non HA è rilasciato dallo stampo, spingere la fine del patibolo lentamente con una spatola per liberarla dallo stampo. Ripetere questo passaggio all'altra estremità del ponteggio e scuotere lo stampo avanti e indietro lentamente in bagnomaria. Controllare se il ponteggio viene spostato all'interno dello stampo.
18. Trasferire il patibolo per un altro bagno di acqua con agitatore attenzione. Non afferrare il patibolo con fermezza, che potrebbe rompere il patibolo. Posizionare il patibolo nel bagnomaria per almeno 3 giorni cambiando l'acqua per filtrare le particelle di sale.
19. Dopo lisciviazione particelle di sale, trasferire ogni impalcatura alla provetta da centrifuga 15 ml riempito con l'acqua deionizzata e metterli in condizioni di asciutto-ghiaccio box per 1 ora di congelare. Mettere provette nel liofilizzatore (tutte le cabine tubo deve essere aperto) e liofilizzare li per 2 giorni.
20. Mettere tutti ponteggi in essiccatore prima fino a quando non vengono utilizzati.

2. Preparazione patibolo per la semina cella

1. Estrarre ponteggi dal essiccatore e tagliarli come 25-30mm di lunghezza.
2. Preparare due tappi di gomma di silicone (diametro = 20 mm, spessore parete = 6.35 mm, diametro del foro centrale = 3 mm) e collegare due tubi in PTFE (diametro esterno = 3.97 mm, diametro interno = 2.38 mm, spessore parete = 0,79 mm, lunghezza = 60 mm e 40 mm) attraverso i fori centro di ogni tappo.
3. Tagliare un anello di HS come 1,5 mm di lunghezza e lo mise in cima ad una delle estremità del ponteggio. Inserire una tubi in PTFE (collegato tappo di gomma di silicone) in fine una delle impalcature più piccolo parte sovrapposte possibile.
4. Mettere il tubo di ponteggio e PTFE in forno a 120 ° C per 10 minuti a ridursi anello SA. Controllare se l'anello SA si restringe e ponteggi sono collegati a tubi in PTFE con fermezza.
5. Estrarre il tubo ponteggio e PTFE e metterli a temperatura ambiente per raffreddare. Mettere il patibolo-PTFE assemblaggio tubo nel tubo di policarbonato (diametro esterno = 15,5 mm, diametro interno = 9 mm, lunghezza = 50 mm) come una camera di bioreattore.
6. Collegare un altro l'estremità del tubo in PTFE al patibolo come passi 2.3) e 2.4).
7. Regolare due tappi di gomma di silicone per attaccare le loro superfici interne ad entrambe le estremità del tubo in policarbonato. Fissare entrambe le superfici esterne dei tappi di gomma di silicone a due piastre in lega di alluminio (alto e basso, larghezza = 20 mm, lunghezza = 70 mm, spessore = 6,35 mm). Mettere due barre filettate nel foro laterale della piastra e fissare il tubo di policarbonato (incluso l'interno scaffold) per le piastre di serraggio dado pollice sulla piastra.
8. Misurare la lunghezza di ogni seedable patibolo (una lunghezza compresa tra due anelli SA) e calcolare l'area della superficie interna (π x lunghezza x diametro interno seedable) di ogni impalcatura per la semina delle cellule.
9. Avvolgere una camera unità bioreattore con foglio di alluminio e sterilizzarlo in autoclave a 120 ° C per 30 min. Sterilizzare ogni parte (serbatoio media, i tubi delle pompe, scambiatori di gas, collettori e valvola a spillo) del bioreattore in autoclave a 120 ° C per 30 min e li assembla all'interno della cappa colture cellulari.
10. Pre-trattamento e risciacquare impalcature con una serie di perfusione (70, 50, e 25% di etanolo per 1 h, PBS (PBS, Mediatech, Herndon, VA) per 2 ore e mezzo di coltura SMC per 24 ore utilizzando una pompa peristaltica a 1,0 ml / min nel circuito di flusso.

3. Semina delle cellule e Cultura

1. Isolare cellule primarie arterie muscolari lisce (SMC) dalle arterie carotidee di giovani babbuini maschi (Papio Anubis) e caratterizzare in due-dimensionali (2D) cultura prima passaging e semina come descritto in precedenza ^9.
2. Espandere SMC utilizzando il MCDB 131 di media (Mediatech, Herndon, VA) con il 10% di siero fetale bovino (Lonza, Walkersville, MD), 1% di L-glutamina (Mediatech), 50 mg / ml di acido ascorbico (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ), e un antibiotico-antimicotico soluzione (10.000 UI / ml di penicillina, 10.000 mg / ml di streptomicina, e 25 mg / ml di amfotericina B; Mediatech).
3. Staccare ogni camera bioreattore dal circuito di flusso nel bioreattore. SMC Seed (passaggio 4-6) al patibolo con una densità di 2x10 ⁶ cellule / cm ^2, iniettando sospensione con siringa da 5 ml nel lume di ponteggi, dopo il taglio sia abluminal (ingresso) e luminale (uscita) dei flussi.
4. Mettete tutte le camere bioreattore nel ibridazione incubatore a 37 ° C e ruotarle a 2 giri per le 4 ore per consentire alle cellule di diffondersi in modo uniforme al patibolo.
5. Estrarre camere bioreattore dalla ibridazione riattaccare incubatore a flusso circuito del bioreattore nel cappuccio. Trasferire tutto il sistema bioreattore nella cultura incubatore cellulare.
6. Collegare il tubo della pompa (diametro interno = 1,6 mm) per la cartilagine di pompa peristaltica e caricare mezzo fresco cultura nel serbatoio. Avviare il tramite parete perfusione (luminale a abluminal) a 1,0 ml / min per 15 minuti seguito da flusso luminale solo.
7. Aumentare la portata e la pressione gradualmente da 1,0 ml / min (stress lume di taglio: 1,1 dyne / cm ²⁾ e 20 mmHg il giorno 1-14,2 ml / min (15,3 dyne / cm ²⁾ e 120 mm Hg il giorno 21, rispettivamente. Cambiare il tubo della pompa (diametro interno = 3,2 mm) al giorno 4 e il mezzo una volta alla settimana.

4. Tessuto raccolta e preparazione del campione per l'analisi

1. Dopo 21 giorni di cultura, fermare la pompa e pinza tubi (ingresso e uscita) del serbatoio mezzo. Staccare il tubo della pompa dalla cartilagine di pompa peristaltica e bioreattori sistema di trasferimento all'interno della cappa.
2. Morsetto di ingresso e uscita tubi di ogni camera di bioreattori e staccarlo dal ciclo di flusso. Aprire il tubo di aspirazione e di preparare un piatto a Petri-il tubo di uscita per raccogliere terreno di coltura all'interno del tubo in policarbonato. Aprire il tubo di uscita lentamente e rimuovere il supporto dalla camera.
3. Staccare l'ago abluminal manometro e tubi in silicone luminale dalla camera e staccare le piastre di alluminio attraverso il rilascio di viti ad alette. Rimuovere il tubo di policarbonato e staccare una delle estremità del tessuto costruire dal tubo in PTFE.
4. Preparare un piatto di Petri-riempite con 10 ml di PBS e staccare altra estremità del costruire dal tubo in PTFE. Mettere costruire in PBS e risciacquare tre volte.
5. Tagliare il costrutto con una lama di rasoio a 5 mm di lunghezza. Congelare congelatore a -80 ° C per analisi biochimiche o trasferirlo a 15 ml per centrifuga tubo riempito con 5 ml di terreno fresco per prove meccaniche o congelare scattano nelle Tissue-Tek mescola ottimale temperatura di taglio (Sakura Finetek Inc., Torrance, CA ) per istologia / immunoflucolorazione orescence.

5. Rappresentante dei risultati:

I ponteggi tubolari PGS sono stati fabbricati utilizzando elastomeri biodegradabile con il metodo di fusione del sale (Fig. 1A). Ogni camera bioreattore fornito ponteggi con flussi sia luminale e abluminal e potrebbe essere distaccato come unità separata da un ciclo di flusso principale (Fig. 1B). Bioreattore sistema è stato progettato per la coltura quattro ponteggi in un momento di controllo e monitoraggio del flusso e di pressione (Fig. 1 C & D).

Schematica della cultura bioreattore è stato mostrato in fig. 2. Dopo la semina SMC, ciascuna camera bioreattore è stata ruotata a 37 ° C per 4 ore a distribuire uniformemente le cellule nel lume del patibolo. E poi, il flusso pulsatile è stato applicato a ponteggi fino al giorno 14 con portata via via crescente (Fig. 2A) e della pressione (Fig. 2B). Dopo il giorno 14, il flusso e la pressione mantenuta costante fino alla fine della cultura (giorno 21).

Morfologia superficiale del patibolo PGS è stata esaminata da microscopia elettronica a scansione (SEM). Scansione microscopio elettronico ha mostrato che patibolo aveva parete coerente spessori (539 ± 18 micron) (Fig. 3A) e distribuiti in modo casuale macro e micro-pori sulla superficie luminale (Fig. 3B). Parametri morfometrici del patibolo è stato misurato da microcomputed tomografia (micro-CT) e analisi di imaging. Dimensione dei pori media è di 23,3 ± 3,9 micron e l'interconnessione dei pori è 99,4 ± 0,62%, il che significa che tutti i pori sono completamente interconnessi in patibolo. Porosità misurata con spostamento etanolo è 75,6 ± 2,7%.

Morfologia cellulare del costrutto PGS è stato esaminato da SEM (Fig. 4). SMC multistrato completamente coperto la superficie luminale ed erano orientato perpendicolarmente alla direzione del flusso. Questi risultati mostrano che il condizionamento meccanico da bioreattore flusso pulsatile supporta l'orientamento SMC nel patibolo.

La presenza della matrice extracellulare (ECM) e fibre elastiche sono stati esaminati dalla colorazione H & E e elastina autofluorescenza (Fig. 5). Colorazione H & E ha dimostrato che le cellule e proteine ​​ECM completamente ricoperto il lume della PGS costrutto. Elastina autofluorescenza ha anche mostrato circonferenza organizzato fibre elastiche sulla superficie luminale del costrutto. Produzione di proteine ​​ECM nei costrutti PGS sono stati misurati da test biochimici. L'elastina insolubile e il contenuto di collagene era 20,2 ± 9,1 mcg / mg di tessuto e del 6,3 ± 1,9 mcg / mg di tessuto, rispettivamente.

Figura 1. Impalcatura fabbricazione e il sistema di bioreattori. (A) Schema di ponteggio tubolare di fabbricazione. (B) camera di bioreattori. Ponteggi erano collegati a tubi in PTFE, posta nel tubo di policarbonato, e fissato da tappi di gomma di silicone e piastre in lega di alluminio. Ogni camera dispone di due percorsi di flusso: flussi luminale (da tubi in silicone) e abluminal (da gauge). (C) sistema di bioreattori posto all'interno dell'incubatore. Esso comprende serbatoio di media, modulo della pompa peristaltica, scambiatore di gas, trasduttori di pressione, due collettori (alto e basso) e valvola a spillo. (D) sistema di bioreattori collocato all'esterno dell'incubatrice. Esso comprende monitorare la pressione, unità di controllo di flusso, sistema di acquisizione dati, e il computer.

Figura 2. Schematica della cultura bioreattore. (A) protocollo Cultura. (B) applicata profili di pressione in ogni momento (giorno 1, 4, 7 e 14).

Figura 3. Morfologia superficiale del patibolo PGS. (A) Sezione. (B) Lumen.

Figura 4. Morfologia cellulare del PGS costrutto. (A) Lumen. (B) Sezione taglio di 45 °. Frecce in entrambe le figure rappresentano la direzione del flusso.

Figura 5. Istologia ed elastina autofluorescenza del PGS costrutto. (A) H & E colorazione. (B) autofluorescenza elastina corrispondente. L: lumen. Ingrandimento: 40X. Scala grafica: 50 micron.

Discussione

La tecnica di fabbricazione utilizzando un elastomero biodegradabile qui descritto ha caratteristiche diverse. (1) Abbiamo usato acido ialuronico (HA) in un comunicato stampo. Dal momento che HA è solubile in acqua, patibolo era facilmente liberato dallo stampo di vetro dopo aver immerso in acqua. In questo rapporto, abbiamo usato 1,0 peso / volume% di soluzione HA perché a bassa concentrazione (<0,5 peso / volume%) di soluzione non è viscoso e scorre così velocemente quando ci si versa sulla parte superiore del tubo di vetro. Alla soluzione di cappotto HA uniformemente, abbiamo capovolto i tubi di vetro quando la soluzione volò giù nella parte inferiore del tubo e ripetuto questo passaggio. Questo rivestimento HA è una critica alla nostra procedura di fabbricazione per il rilascio ponteggi finale. (2) Abbiamo usato termoretraibile (HS) manica per trattenere i sali nel tubo di vetro. Dal momento che i sali erano densamente nello spazio tra la parete interna del tubo di vetro e la manica HS, HS manica mantenuto sali dopo aver rimosso mandrino e anello in PTFE nella parte inferiore del tubo. Potremmo togliere manica HS facilmente mettendo lo stampo in forno a 120 ° C per 5 minuti, e quindi ottenere il sale modelli tubolari. (3) Abbiamo usato il metodo di fusione del sale. E 'noto che la fusione metodo di sale in grado di migliorare l'interconnessione dei pori e le proprietà meccaniche, variando il tempo di fusione ^10. Inoltre, dal momento che abbiamo usato PGS, macro-pori sono stati prodotti dalle particelle di sale durante il processo di lisciviazione, mentre la micro-pori erano probabilmente generato dal vapore glicerolo formano durante PGS curare come abbiamo descritto in precedenza ^11. Così, questo metodo ha un potenziale per fabbricare poroso ponteggi tubolari con diverse macro-e micro-strutture variando particelle di sale e PGS curare condizione.

Il condizionamento meccanico dal bioreattore ha fornito perfusione flusso pulsatile (massima media di flusso = 14 ml / min, la massima sollecitazione di taglio = 15.3 dyne / cm ^2, frequenza = 0,5-1,7 Hz) e fisiologicamente pressione pertinente con l'impalcatura PGS, che ha portato alla SMC crescita e di orientamento (Fig. 4). Questi risultati sono coerenti con gli studi precedenti rapporti che si estendono ciclico a questa frequenza e lo stress di taglio aumenta la proliferazione SMC ^12, e la produzione di proteine ​​ECM ^13,14. Oltre alla crescita SMC e di orientamento, PGS costruire sostenuto la produzione di proteine ​​ECM, specialmente circonferenza organizzato fibre elastiche (Fig. 5) entro 3 settimane cultura del bioreattore. Alcuni studi con un elastomero patibolo come un piccolo diametro costruire arteriosa hanno dimostrato resistenza meccanica e la pressione di scoppio paragonabile ad arterie native ^15, e una rapida integrazione SMC ponteggi compatibile con ogiva fiasco ^16,17, mentre le fibre elastiche non sono stati trovati in questi costrutti. I nostri risultati suggeriscono che la distensione ciclico radiale dal bioreattore migliorato trasduzione del segnale meccanico in modo più efficace di SMC in PGS patibolo, che probabilmente ha contribuito alla sintesi di elastina e di organizzazione.

Dal SMC vascolari sono state le uniche cellule che producevano proteine ​​ECM nel nostro approccio, endotelio quiescente e migliorare la resistenza meccanica sono necessarie per sviluppare una clinica di successo costruisce arteriosi di piccolo diametro. Ci hanno riferito che le cellule endoteliali co-coltura con SMC generato un monostrato confluente e sostenuto l'espressione della proteina fenotipo sotto i nostri condizioni di coltura e di condizionamento meccanico ^9. Pertanto, sulla base delle nostre approccio qui descritto, modifiche di co-coltura condizioni di esperimento sarebbe un passo successivo per migliorare le funzioni di costrutti che ne risulta e generare nonthrombogenic, robusto, e compatibile con arteriosa costruire simili alle arterie native.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo
Acido ialuronico sale sodico	Sigma-Aldrich	H7630
Tetraidrofurano	Sigma-Aldrich	401757
MCDB 131	Mediatech	15-100-CV
Siero fetale bovino	Lonza	BW14-502F
L-glutammina	Mediatech	25-005-CV
Acido ascorbico	Fisher Scientific	A62-500
Antibiotico-antimicotico soluzione	Mediatech	30-004-CI
Soluzione tampone fosfato (PBS)	Mediatech	21-031-CV
Tissue-Tek mescola ottimale temperatura di taglio, 4583	Sakura Finetek	25608-930