Un semplice Hanging goccia Cultura protocollo cellulare per la generazione di sferoidi 3D

Sommario

Descriviamo un metodo semplice, rapido di generare 3D tessuti come sferoidi e la loro potenziale applicazione di quantificare le differenze nelle interazioni cellula-cellula.

Abstract

Studi di cellula-cellula di coesione e adesione cellula-substrato sono storicamente stati effettuati su colture monostrato aderente a substrati rigidi. Cellule all'interno di un tessuto, però, sono in genere racchiusi all'interno di una massa di tessuto stipati in cui le cellule stabilire connessioni intime con molti quasi vicini di casa e con componenti della matrice extracellulare. Di conseguenza, l'ambiente chimico e le forze fisiche sperimentato da cellule all'interno di un tessuto 3D sono fondamentalmente diversi da quelli vissuti da cellule cresciute in coltura monostrato. Questo è stato dimostrato che l'impatto notevolmente la morfologia cellulare e di segnalazione. Diversi metodi sono stati studiati per generare colture di cellule 3D tra cui l'incapsulamento di cellule in gel di collagene ¹ o in biomateriale impalcature ^2. Tali metodi sono utili, ma non ricapitolare l'intimo diretto cellula-cellula architettura di adesione si trovano in tessuti normali. Piuttosto, più da vicino i sistemi di coltura approssimativi in ​​cui le cellule singole sono liberamente disperso all'interno di un reticolo 3D di prodotti ECM. Qui, descriviamo un semplice metodo in cui sono inserite cellule in sospensione cultura goccia e incubate in condizioni fisiologiche fino a formare veri sferoidi 3D in cui le cellule sono in contatto diretto con loro e con i componenti della matrice extracellulare. Il metodo non richiede attrezzature specializzate e può essere adattato per includere l'aggiunta di alcun agente biologico in quantità molto piccole che possono essere di interesse per chiarire gli effetti sulla cellula-cellula o cellula-ECM interazione. Il metodo può essere utilizzato anche per co-coltura due (o più) diverse popolazioni cellulari in modo da chiarire il ruolo di cellula-cellula o cellula-ECM interazioni nello specificare le relazioni spaziali tra le celle. Cellula-cellula e cellula-coesione ECM adesione sono i cardini di studi di sviluppo embrionale, tumore stromale interazione cellula maligna invasione, la guarigione delle ferite, e per applicazioni di ingegneria dei tessuti. Questo semplice metodo fornirà un mezzo per generare tessuti come aggregati cellulari per la misurazione di proprietà biomeccaniche o per l'analisi molecolari e biochimici in un modello fisiologicamente rilevanti.

Protocollo

1. Preparazione di una sospensione singola cella

1. Colture di cellule aderenti dovrebbe essere cresciuta al 90% di confluenza, monostrati dopo di che devono essere risciacquati due volte con PBS. Dopo aver svuotato bene, aggiungere 2 ml (per 100 piastre mm) del 0,05% tripsina-1 mM EDTA, e incubare a 37 ° C fino a staccare le cellule. Fermare tripsinizzazione aggiungendo 2 ml di terreno completo e delicatamente utilizzare un pipetta da 5 ml per triturare il composto fino a quando le cellule sono in sospensione. Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml.
2. Aggiungere 40 ml di un 10 mg / ml di DNAsi fotografici e incubare per 5 minuti a temperatura....

Discussione

Gli studi hanno dimostrato che le cellule in coltura tridimensionale contesto (3D) produce distinte morfologia cellulare e di segnalazione rispetto ad un rigido bidimensionale (2D) sistema cultura ^9. Per esempio, fibroblasti popolate gel collagene dimostrare che la morfologia dei fibroblasti in 3D è ben distinta da quella osservata in 2D ^10,11. Allo stesso modo, la cultura 3D può indurre tessuto-specifica differenziazione delle cellule epiteliali mammarie. Sistemi di coltura 3D sono stati utilizzat.......

Materiali