Un metodo rapido per ottenere leucociti infiltrati dal cervello murino è descritto. Questo metodo utilizza una pendenza costante Percoll e gradiente discontinuo di Ficoll selezionare e purificare i leucociti arricchito strato. Leucociti isolati può quindi essere caratterizzata da misure di citometria a flusso.
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Articolo metodologico
Isolamento di Brain-infiltrazione Leucociti
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Descriviamo un metodo per la preparazione di leucociti cervello infiltrante (Bils) dai topi. Noi dimostrare come infettare topi con encefalomielite Theiler ha murino virus (TMEV) attraverso una tecnica rapida iniezione intracranica e come purificare un leucociti arricchito popolazione di cellule infiltrati dalla intero cervello. In breve, i topi vengono anestetizzati con isoflurano in una camera chiusa e sono a mano libera iniettato con una siringa Hamilton nella corteccia frontale. I topi sono poi uccisi in vari momenti dopo l'infezione da overdose isoflurano e cervelli interi vengono estratti e omogeneizzato in RPMI con una smerigliatrice tessuto Tenbroeck. Omogenati cerebrali sono centrifugate con una pendenza costante Percoll 30% per rimuovere i detriti cellulari mielina e gli altri. La sospensione cellulare viene quindi filtrato a 40 micron, lavato e centrifugato su un discontinuo Ficoll-Paque Plus. gradiente di selezionare e purificare i leucociti. I leucociti vengono poi lavate e risospese in buffer appropriato per immunofenotipizzazione mediante citometria di flusso. Citometria a flusso rivela una popolazione di cellule del sistema immunitario innato nelle fasi precoci dell'infezione nei topi C57BL / 6. A 24 ore dopo l'infezione, più sottoinsiemi di cellule immunitarie sono presenti nel Bils, con una popolazione arricchita del Gr1 +, CD11b F4/80 + + e cellule. Pertanto, questo metodo è utile per caratterizzare la risposta immunitaria alle infezioni acute del cervello.
Protocollo
1. Virus iniezione intracranica:
La seguente tecnica è stato modificato ed utilizzato ampiamente dal nostro laboratorio e colleghi. In breve, l'iniezione di tensione intracranica Daniel di Theiler ha murino encefalomielite virus (TMEV) o sham-infezione (1, 10) viene eseguita su topi giovani (preferibilmente 5-6 settimane di età), per sollecitare leucociti cervello infiltrante (Bils). Si prega di notare che i risultati saranno diversi tra il ceppo di Daniel, il ceppo BEAN, e il ceppo GDVII. Ai fini della raccolta Bils, topi ricevere 2x10 5 PFU di TMEV e sono infettate per 24 ore.
- Applicare l'ago di iniezione (27 gauge....
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Discussione
Noi abitualmente uso di citometria a flusso per determinare sia la qualità della preparazione infiltrazione delle cellule cerebrali, e per distinguere le diverse popolazioni di cellule immunitarie 2, 9. Al acuta intervalli di tempo, il nostro metodo Bils rese elevate percentuali di monociti infiammatorio all'interno della popolazione CD45hi così come alte percentuali di macrofagi nella popolazione CD45lo. Ciò indica che una risposta immunitaria riproducibile all'interno del cervello possono essere rob.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione NS64571 dal NINDS (CLH), con un premio primi stadi dello sviluppo della carriera della Mayo Clinic (CLH), e da un generoso regalo di Donald e Frances Herdrich (CLH). Vorremmo ringraziare il Core Mayo Clinic Citometria a flusso per l'assistenza.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| TMEV | Howe Lab | N / A | |
| Ceppo di Daniel | Invitrogen | 21063-029 | |
| isoflurano | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| a fondo tondo da Oak Ridge centrifuga tubi | Nalgene | 3118-0030 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| 10X PBS | Roche | 11666789001 | |
| Ficoll-Paque Plus. | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Tricloroetano 0,4% (w / v) | Mediatech | 25-900-CI | |
| Provette da 15 ml | BD Falcon | 352097 | |
| 7 ml di vetro Pyrex marchio Tenbroeck tessuto smerigliatrice | Pescatore | 08-414-10B | |
| 40 micron filtro cellulare | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml coniche | BD Falcon | 352070 | |
| albumina di siero bovino | Sigma | A9647 | |
| di sodio azide | Sigma | S8032 | |
| CMF-PBS | Mediatech | 21-040-CV | |
| FACS tubi | BD Falcon | 352054 | |
| siero fetale bovino | Sigma | F4135 | |
| 2.4G2 ibridomi | ATCC | HB-197 | |
| Costar V-piastra inferiore | Corning | 3894 | |
| Allegra X-22R centrifuga o equivalente | Beckman | N / A | |
| 96-bene secchio piastra e rotore | Beckman | S2096 | |
| Rotore ad angolo fisso | Beckman | F0360 | |
| paraformaldeide | Sigma | P6148 | |
| BD FACS Calibur | BD Biosciences | N / A | |
| FlowJo 7,5 | Albero Star, Inc. | N / A | |
| CD45 | BD Biosciences | 557235 | clone: 30-F11 |
| GR1 (Ly6C / G) | BD Biosciences | 553128 | clone: RB6-8C5 |
| CD11b | ebiosciences | 17-0112-83 | clone: M1/70 |
| F4/80 | ebiosciences | 17-4801-82 | clone: BM8 |
Riferimenti
- Buenz, E. J., Howe, C. L. Picornaviruses and cell death. Trends Microbiol. 14, 28-36 (2006).
- Buenz, E. J., Limberg, P. J., Howe, C. L. A high-throughput 3-parameter flow cytometry-based cell death assay. Cytometry A. 71, 170-173 (2007).
- Deb, C., Lafrance-Corey, R. G., Zoecklein,....
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Ristampe e permessi
