Costo-efficace metodo per il rilevamento di origine microbica Utilizzando specifici virus umani e animali

Summary

Lo studio descrive un metodo conveniente per l'identificazione della fonte di contaminazione fecale / urina o la contaminazione da nitrati in acqua utilizzando qPCR per la quantificazione specifica di virus DNA umano / suini / bovini, adenovirus e poliomavirus, proposti come strumenti di MST.

Abstract

La contaminazione microbica dell'ambiente rappresenta un rischio significativo per la salute. Classica indicatori batterici fecali hanno dimostrato di avere notevoli limitazioni, i virus sono più resistenti ai processi di inattivazione molti indicatori e standard fecale non informare sulla fonte di contaminazione. Lo sviluppo di metodi economici per la concentrazione di virus da acqua e saggi molecolari facilita l'applicabilità di virus come indicatori di contaminazione fecale e come fonte microbica tracking (MST) strumenti. Adenovirus e poliomavirus sono virus a DNA infettare specie di vertebrati specifici compresi gli esseri umani e sono costantemente escreto nelle feci e / o urine in tutte le aree geografiche studiate. In studi precedenti, abbiamo suggerito la quantificazione di adenovirus umani (HAdV) e poliomavirus JC (JCPyV) mediante PCR quantitativa (qPCR) come indice di contaminazione fecale umana. Recentemente, abbiamo sviluppato saggi qPCR per la quantificazione specifica di poradenovirus cine (PAdV) e poliomavirus bovina (BPyV) come animali indicatori di contaminazione fecale con sensibilità di copie del genoma 1-10 per provetta. In questo studio, presentiamo la procedura da seguire per identificare la fonte di contaminazione nei campioni di acqua di questi strumenti. Come esempio dei risultati rappresentativi, l'analisi dei virus nelle acque sotterranee presenta alti livelli di nitrati è mostrato.

Individuazione di virus in acque inquinate o moderatamente bassa richiede la concentrazione del virus da almeno diversi litri di acqua in un volume molto più piccolo, una procedura che di solito comprende due fasi concentrazione in serie. Questa procedura alquanto complesso e la variabilità osservata in recuperi virale ostacolare in modo significativo l'elaborazione simultanea di un gran numero di campioni di acqua.

Al fine di eliminare il collo di bottiglia causato dai due procedure dettagliate abbiamo applicato un passo protocollo sviluppato in Studie precedentes ed applicabile ad una varietà di matrici acqua. La procedura prevede: l'acidificazione di dieci litri di campioni di acqua, flocculazione da latte scremato, sedimentazione dei materiali flocculato, la raccolta del precipitato e centrifugazione, risospensione del precipitato in 10 ml di tampone fosfato. Il concentrato virale è utilizzato per l'estrazione di acidi nucleici virali e l'adenovirus specifico e poliomavirus di interesse sono quantificati da qPCR. Elevato numero di campioni può essere contemporaneamente analizzate con questo metodo a basso costo concentrazione.

La procedura è stata applicata per l'analisi delle acque di balneazione, l'acqua di mare e di acqua di fiume e in questo studio, presentiamo i risultati analizzando campioni di acque sotterranee. Questo high-throughput metodo quantitativo è affidabile, semplice e conveniente.

Protocol

1. Concentrazione delle particelle virali presenti nei campioni di acqua

1. Raccolta e condizionamento dei campioni di acqua
   1. Raccogliere un minimo di 2 repliche di 10 litri per campione in contenitori di plastica con fondo piatto e un campione in più come un controllo di processo. Questo ultimo esempio sarà arricchito con una quantità nota di particelle virali e utilizzato come controllo.
      Nota: Si raccomanda di avere particolari materiali utilizzati (bottiglie, tubi, ecc) per i campioni a spillo.
   2. Controllare la taratura del conduttimetro e ricalibrare se necessario. Preparare un controllo negativo utilizzando l'acqua del rubinetto in p....

Discussion

La procedura descritta potrebbe soddisfare le condizioni per un metodo adatto per routine laboratori ambientali e sanitarie: riproducibile, affidabile, semplice e conveniente. Il protocollo è semplice, ma che devono essere seguite attentamente. Bassa conducibilità nei campioni senza aggiungere la concentrazione richiesta di sali di acqua di mare artificiale ridurrebbe drasticamente il recupero di virus come sarebbe il caso se il tempo di agitazione per la flocculazione è significativamente ridotto (meno di 5 ore p.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Centrifuga ad alta velocità (8.000 xg)	Berckman Coulter	Avanti J-20XP
pH-metro, termometro e conduttimetro	Afora	LPPC3003
Tubi di plastica 100-200 cm di lunghezza	DeltaLab	350059
Pipette graduate sterili monouso	Labclinics	PN10E1
Sterili tubi di plastica di 1,5 e 10-15 ml (Eppendorf, Falchi, ecc)	Afora	KA298/00
Pentole centrifuga (500 ml)	Fisher Scientific	SE5753512
Agitatori magnetici e magneti (uno percampione)	Fisher Scientific	10510
Contenitori di vetro o plastica, che ha fondo piatto per consentire l'uso di agitatori magnetici	DeltaLab	191642
Una pompa peristaltica per la rimozione del surnatante (o un getto d'acqua pompa del vuoto)	Watson-Marlow	323E / D
Timer per lo spegnimento l'agitazione dopo 8-10 ore	DeltaLab	900400
Acido cloridrico (1N e 0,1 N)	Panreac	141020.1611
Idrossido di sodio (1N)	Panreac	131687.1211
Artificiale con acqua di mare mare sali	Sigma	S9883
Latte scremato (SM)	Difco	232100
Tampone fosfato a pH 7, 5			01:02 v / v di sterile Na 2 HPO 4 0,2 M e NaH 2 PO 4 0,2 M a pH 7,5
Tiosolfato	Panreac	121879.1209	Fai una soluzione al 10% in acqua
QIAamp Viral RNA Mini Kit	Qiagen	52904
96-pozzetti di reazione ottico (500 unità)	Applied Biosystems	43426659
Ottico copre adesivo (100 unità)	Applied Biosystems	4311971
TaqMan Ambientale PCR Master Mix 2x	Applied Biosystems	4396838