Articolo metodologico

Metodo di particelle agglutinazione per l'identificazione Poliovirus

DOI:

10.3791/2824

⸱

20 aprile 2011

 ,  ,  , 
1Department of Virology II, National Institute of Infectious Diseases, 2New Product Design Department, Fujirebio Inc.

In questo articolo

Sommario

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Un recente sviluppo di particelle romanzo agglutinazione (PA) test utilizzando molecola recettore del virus ha permesso l'identificazione rapida e facile dei poliovirus (PV). In questo articolo mostreremo la procedura per il saggio PA per l'identificazione fotovoltaico.

Abstract

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Nel Global Polio Eradication Initiative, diagnosi di laboratorio svolge un ruolo critico, isolando e identificando PV dai campioni di feci di paralisi flaccida acuta (AFP) casi. Nel Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) Global Polio Laboratory Network, PV isolamento e l'identificazione sono attualmente in corso, utilizzando la cultura sistema di celle e real-time RT-PCR, rispettivamente. Nell'era post-eradicazione era del fotovoltaico, procedure di identificazione semplice e rapida sarebbe utile per una rapida conferma di casi di polio presso i laboratori nazionali. Nel presente studio, mostreremo la procedura di test romanzo PA sviluppato per l'identificazione fotovoltaico. Questo test PA utilizza l'interazione del recettore PV (PVR) e virione molecola che è specifica affinità e uniforme a tutti i sierotipi del fotovoltaico. La procedura è semplice (una procedura passo in lastre di reazione) e rapido (risultati possono essere ottenuti entro 2 h di reazione), e il risultato è visivamente osservato (osservazione di agglutinazione di particelle di gelatina).

Protocollo

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1. Preparazione del terreno di mantenimento (MM) e una crescita media (GM)

Per la preparazione di MM e GM, consultare un manuale Polio laboratorio dell'OMS 1. Medio Dulbecco modificato Eagle (DMEM) arricchito con il 2% di siero fetale bovino (FCS) e il 10% di FCS potrebbero essere utilizzati come sostituti di MM e GM, rispettivamente.

2. Preparazione di anticorpi anti-PV

  1. Ricostituire anticorpi anti-PV (PV RIVM digitando antisiero) con l'aggiunta di acqua (0,5 ml per flaconcino) per ogni flaconcino di anticorpi anti-PV (tipo 1, 2 o 3). Aggiungi questo anticorpo soluzioni ricostituite (0,5 ml ciascuno) a 4,5 ml di MM in tubi separati etichettati.
    Nota: alcuni lotti di anticorpi anti-PV sono forniti come forma ricostituito (0,5 ml per flaconcino). Per il lotto di tali anticorpi anti-PV, aggiunta di acqua per la ricostituzione non è necessaria.
  2. Mescolare uguale volume di ricostituito anticorpi anti-PV. Per anti-PV1 +2, 2 +3 o 3 +1: Mescolare 1,8 ml di ciascun anticorpo ricostituito (1,8 ml + 1,8 ml = 3,6 mL per ciascuna miscela). Per anti-PV1 +2 +3: Mescolare 1,2 ml di ciascun anticorpo ricostituito (1,2 ml + 1,2 ml + 1,2 ml = 3,6 mL).
    Nota: i campioni PV potrebbe contenere una miscela di diversi sierotipi del fotovoltaico. Per identificare il sierotipo singolo del fotovoltaico in campioni con miscela di PV, pool di anticorpi anti-PV (cioè 1 +2, 2 +3, 3 +1, 1 +2 +3) è necessario.
  3. Aggiungere il volume 1 / 5 di FCS (0,72 ml) per ogni anti-PV (1 +2, 2 +3, 3 +1 o 1 +2 +3) anticorpi (3,6 mL) (finale 18,2% FCS).
    Nota: L'aggiunta di FCS sia per la riduzione della non-specifici agglutinazione di particelle di gelatina causata da anticorpi.
  4. Mantenere le piscine degli anticorpi a -20 ° C fino all'utilizzo nei test PA.

3. Ricostituzione di gelatina sensibilizzata particelle

  1. Aggiungere 1,5 mL di tampone ricostituzione inclusi nel kit di un flaconcino di particelle di gelatina sensibilizzata (fornito come polvere liofilizzata).
  2. Mescolare bene picchiettando leggermente
  3. Mantenere la particella ricostituito sensibilizzato a 4 ° C. Ricostituito particelle gelatina potrebbe essere attiva almeno 2 settimane a 4 ° C, ma deve essere preparato poco prima del test.

Nota importante:
Non mescolare molto diverso di particelle di gelatina sensibilizzata, perché il non-agglutinazione immagine di particelle di gelatina sensibilizzata potrebbe essere diverso dal lotto delle particelle. Per ogni esperimento, un singolo lotto di gelatina sensibilizzata particella dovrebbe essere usato.

4. PA test per l'identificazione PV

  1. Preparare una micro-titolazione piatto. Per l'identificazione di un campione di virus, abbiamo bisogno di 5 pozzi + almeno un controllo negativo (particelle sensibilizzati senza virus e anticorpi, ben n. 6 di seguito. See No controllo del virus e anticorpi in esempio). Numero totale dei pozzi è di 5 x campioni + almeno un controllo nel saggio.
    Nota importante:
    Si prega di prendere almeno un non controllo del virus e anticorpi nel saggio. Un flaconcino di particelle sensibilizzati circa l'identificazione di 10 campioni del virus.
  2. Aggiungere 12 microlitri / pozzetto di anticorpi anti-PV o GM al micro-titolazione piatto. La disposizione del piatto è la seguente (Vedi anche Esempio di seguito). Nei campioni senza anticorpi (camera n. 1 e 6), aggiungere 12 ml di GM invece di anticorpi anti-PV.
    Nota importante:
    Se molti campioni PV dovrebbero essere testati in questo saggio, pipetta multicanale o distributore sarebbe utile per questo passo.
    Bene # 1 Bene # 2 Bene # 3 Bene # 4 Bene # 5 Bene # 6
    GM anti-P1 +2 +3 anti-P1 2 anti-P2 3 ani-P1 3 GM
  3. Aggiungere 12 microlitri / pozzetto di campione virus. In un campione senza virus (o meglio # 6), aggiungere 12 ml di GM al posto della soluzione di virus.
    Nota: campione di virus è supernatante della coltura delle cellule infettate, le cellule di solito L20B o cellule RD.
    Nota importante:
    Se molti campioni PV dovrebbero essere testati in questo saggio, pipetta multicanale sarebbe utile per questo passo.
    Bene # 1 Bene # 2 Bene # 3 Bene # 4 Bene # 5 Bene # 6
    virus campione virus campione virus campione virus campione virus campione GM
  4. Prendere soluzione ricostituita sensibilizzati particelle da 4 ° C a temperatura ambiente, e picchiettare delicatamente di sospendere completamente le particelle.
    Nota importante:
    Dopo la sospensione completa delle particelle picchiettando leggermente, le particelle dovrebbero essere aggiunti immediatamente ai piatti prima della particelle sospese precipitazionite e la forma non omogenea soluzione.
  5. Aggiungere 25 microlitri / pozzetto di particelle sensibilizzati a tutti i pozzetti.
    Nota importante:
    Dopo l'aggiunta di particelle sensibilizzate, la piastra deve essere immediatamente sottoposto a piastra di miscelazione per iniziare la reazione uniforme dei campioni. Pertanto, l'aggiunta di particelle sensibili deve essere effettuata utilizzando dosatore per minimizzare un intervallo di tempo tra i campioni nel piatto.
  6. Mettere il micro-titolazione piastra su un piatto e mixer miscelare la piastra per 30 sec.
  7. Mettere il micro-titolazione piastra su carta bianca (per comodità di osservazione visuale) su un tavolo a temperatura ambiente (15 ~ 30 ° C) per 2 ore
    Nota importante:
    Non spostare la piastra durante e dopo la reazione per l'osservazione dei risultati e fotografare. L'agglutinazione formato non è stabile e facilmente disturbati dal movimento delle piastre.
  8. Scatta foto del piatto.
    Nota importante:
    Veduta parziale della foto non poteva dare dati sufficienti per il successivo esame e la revisione dei risultati per l'interpretazione. Diverse foto dovrebbe essere preso per coprire tutti i pozzetti delle piastre di messa a fuoco l'immagine agglutinazione dei pozzi.

5. Interpretazione dei risultati

  1. L'identificazione dei pozzetti positivi e negativi. Confrontare le agglutinazione nei campioni con quella di nessun controllo dei virus e degli anticorpi (precipitazione di particelle di gelatina, non agglutinazione) (Figura 1 e 2). Immagini di agglutinazione che sono chiaramente distinti dalle Nessun virus e nessun controllo di anticorpi (non agglutinazione, controllo negativo) dovrebbe essere giudicata positivamente, e le immagini di agglutinazione che sono simili al controllo negativo deve essere giudicato negativo. I campioni che mostrano agglutinazione evidente, ma solo parziale potrebbe essere giudicata positivamente, ma record come 'positivo (agglutinazione parziale)'.
  2. Identificazione del fotovoltaico. Interpretare i risultati sulla base di pozzetti positivi e negativi con anticorpi anti-PV per identificare i sierotipi fotovoltaico. Principio della interpretazione del risultato è simile a quella del test di neutralizzazione del sistema di coltura cellulare (ad esempio positivo per anti-P1 due anticorpi indica che il campione contiene tipo 3 PV).

6. Rappresentante Risultati

Risultato rappresentativo della PA test PV identificazione è mostrata in Figura 1. Tutti i ceppi PV formata agglutinazione di particelle di gelatina sensibilizzata (senza anticorpi campioni). In presenza di corrispondenti anticorpi anti-PV, la precipitazione di particelle di gelatina (non-agglutinazione) simile a No virus e nessun controllo di anticorpi (controllo negativo) è stato osservato (ad esempio, PV1 (Sabin) in presenza di anti-P1 +2 o anti-P3 1 anticorpi).

figure-protocol-1
Figura 1. Le soluzioni antivirus identificazione del fotovoltaico mediante test PA. Di PV1 (Sabin), PV2 (Sabin), e PV3 (Sabin) (titoli virus di 1,2 x 10 8 CCID 50 / 12 microlitri, 8,2 x 10 7 CCID 50 / 12 microlitri, e 3,5 x 10 7 CCID 50 / 12 microlitri, rispettivamente) sono stati utilizzati per l'identificazione mediante test PA. Nessun virus e nessun controllo di anticorpi hanno mostrato precipitazione di particelle di gelatina (non-agglutinazione, controllo negativo).

figure-protocol-2
Figura 2. Interpretazione dei pozzi positivi e negativi. Soluzioni antivirus di PV1 (Sabin), PV2 (Sabin), e PV3 (Sabin) (titoli virus di 2,4 x 10 8 CCID 50 / 25 microlitri, 1,7 x 10 8 CCID 50 / 25 microlitri, e 7,3 x 10 7 CCID 50 / 25 microlitri, rispettivamente) sono stati diluiti 1 / 20 a 1 / 320, e poi 25 ml di campioni diluiti sono stati esaminati mediante test PA senza anti-PV anticorpi.

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Discussione

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L'unico punto di questo test PA è l'utilizzo della molecola PVR invece di anticorpi anti-PV per il rilevamento di PV 2. Questo consente una specifica interazione delle particelle di gelatina sensibilizzata con PV con una affinità uniforme per tutti e tre i sierotipi di PV 3-6. Abbiamo usato una forma immunoadhesin di PVR (PVR-IgG2a) per la sensibilizzazione delle particelle di gelatina, in quanto forme monomeriche di PVR hanno solo affinità moderata al singolo sito vincolanti per le virione (costante ...

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Dichiarazioni

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Souji Masujima è un dipendente di New Product Design Department, Fujirebio Inc.

Ringraziamenti

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Siamo grati a Junko Wada per la sua eccellente assistenza tecnica. Siamo grati al Prof. Akio Nomoto per la gentile fornendo un vettore di espressione baculovirus per PVR-IgG2a. Questo studio è stato sostenuto in parte da sovvenzioni-in-Aid per la promozione della eradicazione della polio e della Ricerca sulle emergenti e riemergenti Malattie Infettive del Ministero della Salute, del Lavoro e del Welfare.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nome del reagente Azienda Numero di catalogo Commenti
Gelatina sensibilizzata-particelle Fujirebio Inc. Kit per il test
Ricostituzione del buffer Fujirebio Inc. Kit per il test
Piastra di microtitolazione Fujirebio Inc. Kit per il test
Anticorpi anti-PV RIVM

Riferimenti

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  1. World Health Organization. Polio Laboratory Manual (4th edition) WHO/IVB/04.10. , 4th Edition, World Health Organization. (2004).
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