Descriviamo un metodo per elaborare e schermo campo raccolti zanzare per una varietà di virus mediante test Vero colture cellulari. Utilizzando questa tecnica, abbiamo rilevato 9 virus diversi da 4 famiglie tassonomiche nelle zanzare raccolte nel Connecticut.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Il rilevamento del virus infettivo da Campo-zanzare raccolte mediante test coltura cellulare Vero
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le zanzare trasmettono un certo numero di diversi virus tra cui importanti patogeni umani come il virus West Nile, virus dengue, virus e chickungunya. Molti di questi virus hanno intensificato nelle loro gamme endemiche e esteso a nuovi territori, che richiedono efficaci programmi di sorveglianza e di controllo per rispondere a queste minacce. Una strategia per monitorare l'attività dei virus prevede la raccolta di un gran numero di zanzare da siti endemiche e il loro test per l'infezione virale. In questo articolo viene descritto come gestire, elaborare e schermo campo raccolti per le zanzare virus infettivo mediante test Vero colture cellulari. Le zanzare sono ordinati in base alla località trappola e specie, e raggruppati in vasche contenenti ≤ 50 individui. I campioni in pool sono omogeneizzati in soluzione salina tamponata con un mixer-mulino e la fase acquosa viene inoculata in colture cellulari confluenti Vero (Clone E6). Le colture cellulari sono monitorati per effetto citopatico da 3-7 giorni post-inoculazione e qualsiasi virus coltivato in colture cellulari sono identificati dal test diagnostico appropriato. Utilizzando questo approccio, abbiamo isolato 9 virus diversi da zanzare raccolte nel Connecticut, Stati Uniti, e tra questi, 5 sono noti per causare la malattia umana. Tre di questi virus (West Nile virus, virus Potosi, e La Crosse virus) rappresentano i nuovi record per il Nord America o la regione del New England dal 1999. La capacità di rilevare un'ampia gamma di virus è fondamentale per il monitoraggio sia stabilita e virus emergenti nella popolazione di zanzare.
Protocollo
1. Mosquito smistamento e identificazione
- Le seguenti procedure vengono eseguite su un banco in un laboratorio aperto dedicato biosicurezza di livello-2 (BSL-2) da personale di laboratorio che sono addestrati a lavorare con le zanzare dal vivo. Una "catena del freddo" è mantenuta per tutta la procedura.
- Anestetizzare vivono zanzare adulte mettendo borsa zanzara raccolta in un congelatore -20 ° per 5 minuti. Trasferimento sacca di raccolta in un contenitore isolato contenente ghiaccio secco. Chiudere il coperchio ed esporre le zanzare di anidride carbonica per 1-3 minuti per garantire la completa knock-down.
- Toccare le zanzare anestetizz....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Test su cellule Vero cultura serve come un metodo efficace per lo screening sul campo raccolte zanzare per una varietà di virus. Questo contrasta con metodi molecolari che specificamente di mira uno o alcuni virus di interesse. Inoltre, abbiamo trovato che il Vero saggio coltura cellulare è altrettanto se non più sensibile di RT-PCR 7 e ci fornisce isolati di virus che sono memorizzati nella nostra collezione di riferimento per studi futuri. Tuttavia, i sistemi di coltura cellulare non può essere opportuno in.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Noi riconosciamo con gratitudine gli importanti contributi di Drs. John Anderson, Andrew principale e Shirley Tirrell a questo studio. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni provenienti dal Centers for Disease Control and Prevention (U50/CCU116806-01-1) e il Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti (58-6615-1-218, CONH00768 e CONH00773).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente / attrezzature | Azienda | Numero di catalogo | |
| Siero fetale bovino | Gibco - Invitrogen | 16140 | |
| Anti-biotic/mycotic | Gibco - Invitrogen | 15240 | |
| Bicarbonato di sodio NaHCO 3, 7,5% Soln. | Gibco - Invitrogen | 25080 | |
| L-Glutammina 100x 200mm | Gibco-Invitrogen | 25030 | |
| Polvere terreno minimo indispensabile (MEM) | Gibco - Invitrogen | 11700 | |
| 10X PBS Dulbecco | Gibco - Invitrogen | 14080 | |
| Tripsina-EDTA | Gibco - Invitrogen | 15400 | |
| Siero di coniglio | Gibco - Invitrogen | 16120 | |
| Le cellule Vero (Clone E6) | ATCC | CRL-1586 | |
| Tessuto di piccole fiasche cultura, tappi ventilati, 25 cm 2 | Falcon - Becton Dickinson | 353112 | |
| Grandi fiaschi del tessuto culturale, tappi ventilati, 175 cm 2 | Falcon - Becton Dickinson | 353108 | |
| Rame rivestita di BB, 4,5 millimetri | Crosman | 0767 | |
| Mixer Mill | Retsch | MM300 | |
| IsoPack congelatore rack | Eppendorf | 022510240 |
Riferimenti
- Chosewood, L. C., Wilson, D. E. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , 5 edn, U.S. Government Printing Office. (2007).
- Anderson, J. F. Isolation of West Nile virus from mosquitoes, crows, and a Cooper's hawk in Connecticut. Science. 286, 2331-2333 ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
