Low-Cost Cryo-Stage Light fabbricazione microscopia per Luce correlate / Microscopia Elettronica

Sommario

Dimostriamo la realizzazione di un basso costo stadio criogenico progettato per adattarsi microscopi a luce riflessa più. Questo laboratorio costruito fase criogenica consente efficiente e affidabile di imaging correlativa tra crio-crio-luce e microscopia elettronica.

Abstract

L'accoppiamento di crio-microscopio luce (crio-LM) e crio-microscopia elettronica (cryo-EM) pone una serie di vantaggi per comprendere le dinamiche cellulari e ultrastruttura. In primo luogo, le cellule possono essere esposte in un ambiente vicino nativo per entrambe le tecniche. In secondo luogo, a causa del processo di vetrificazione, i campioni sono conservati da una rapida immobilizzazione fisica piuttosto che la fissazione chimica lenta. In terzo luogo, l'imaging lo stesso campione sia con crio-LM e Cryo-EM offre la correlazione di dati provenienti da una singola cellula, piuttosto che un confronto tra "campioni rappresentativi". Mentre questi benefici sono ben noti da studi precedenti, l'uso diffuso di correlativo crio-LM e Cryo-EM rimane limitata a causa delle spese e la complessità di acquisto o costruzione di un palcoscenico adatto criogenico microscopia ottica. Qui mostriamo il montaggio e l'uso di una fase economica criogenico che possono essere fabbricate in ogni laboratorio per meno di $ 40 con parti disponibili all'indirizzo ferramenta e negozi di alimentari. Questo crio-LM stadio è stato progettato per l'utilizzo con microscopi luce riflessa che sono dotati di obiettivi a lunga distanza di lavoro aria. Per correlativo crio-LM e Cryo-EM studi, adattiamo l'uso di carbonio rivestito standard 3 mm Cryo-EM griglie come supporti campione. Dopo adsorbente il campione alla rete, i protocolli precedentemente stabilito per vetrificanti il ​​campione e il trasferimento / gestione della rete sono seguite per permettere a più tecnica di imaging. Come risultato, questa configurazione consente a qualsiasi laboratorio con un microscopio a luce riflessa di avere accesso a immagini correlativo diretto di campioni congelati idratata.

Protocollo

1. Fabbricazione e montaggio

1. Collocare il dissipatore di calore in alluminio all'interno del 22,96 centimetri (9 ") pan torta di circa 2 cm dal lato della vaschetta, come mostrato nella Figura 1c Usando una penna nera pennarello, segnare i fori per il dissipatore di calore in alluminio Note:.. Se l'alluminio blocco (acquistato in un negozio locale rottami metallici o online all'indirizzo http://www.onlinemetals.com ) non sono dotati di fori predisposti, è necessario organizzare per avere fori e svasati prima del passaggio 1 per assicurare l'alluminio blocco nella padella torta. Abbiamo usato 5 fori per fissare il blocco alla piattaforma e 4 fori supplementari per permettere bolle di gas di azoto per sfuggire da sotto il alluminio.
2. Posizionare la griglia di crio-box vicino alla posizione del dissipatore di calore in alluminio e segnare la tacca e ogni lato.
3. Praticare dei fori pilota per ogni posizione contrassegnata con un po '# 17 trapano per i fori in alluminio dissipatore di calore e un po' # 35 trapano per la crio-griglia di fori box.
4. Montare il dissipatore in alluminio con 5 - # 10, 1,9 centimetri (3 / 4 ") a testa piana con intaglio bulloni e dadi corrispondente così come 15 - # 10 rondelle Inserire due rondelle sotto il blocco di alluminio e il terzo sul retro del. torta di pan per ciascun foro. Nota: sbalzi chirografari del blocco di alluminio presso l'area di visualizzazione può risultare in vibrazioni che limitano le capacità di imaging del palcoscenico Verificare che tutti i bulloni di fissaggio siano ben serrati..
5. Inserire 3 - # 4, 0,95 centimetri (3 / 8 ") rotondo scanalato bulloni e dadi corrispondente dalla parte posteriore della torta di pan di agire come la finestra di montaggio crio-griglia.
6. Nastro 4 bacchette insieme a coppie con una bacchetta sopra l'altro. Nastro ogni coppia di spigoli opposti della tortiera di agire come distanziatori.
7. Bagnare la superficie superiore e inferiore della torta e torta di pentole, rispettivamente con DDH ₂ O.
8. Riempire la tortiera con due strati di schiuma isolante spray. Bagnare ogni strato prima di passare alla fase successiva.
9. Premere il pan torta nella schiuma.
10. Capovolgere le pentole a testa in giù e premere sul tortiera fino a quando i distanziatori contattare la padella torta. Collocare alcun oggetto ponderata in cima alla tortiera e lasciate riposare durante la notte per curare.
11. Con un coltello seghettato, tagliare via l'eccesso essiccato isolante in schiuma spray dal bordo delle pentole e rimuovere le bacchette.
12. Togliere la tortiera dal tegame torta. La pentola a torta con dissipatore di calore in alluminio è ora isolato e sarà denominato "stadio criogenico" (Fig. 1a).
13. Inserire una Appunti di plastica trasparente (di qualsiasi colore e superiore a 3 mm di spessore) sopra la parte superiore del palco criogenico. Segnare con un pennarello nero la posizione del crio-grid montare box disegnando un cerchio di circa 1,5 volte il diametro di un singolo round crio-grid box. Tagliare foro con un 1,9 centimetri (3 / 4 ") sega a tazza. Appunti Questa sarà denominato" schermata di caricamento "(Figura 1b).
14. Mettere un nuovo appunti trasparente in cima alla fase criogenici e posto sul microscopio con il dissipatore di calore direttamente sotto le lenti dell'obiettivo. Con un pennarello nero, segnano il cammino degli obiettivi mentre ruotano.
15. Tagliare lungo la linea segnata la rimozione di un mezzo cerchio dal bordo degli appunti. Questo può essere realizzato con un seghetto o con un 7,62 cm (3 ") buco visto più volte come mostrato nel video.
16. Infine tagliare un 1,9 centimetri (3 / 4 ") buco di distanza dal mezzo cerchio, ma ancora all'interno dell'area del piatto. Questa sarà la porta per il riempimento di azoto liquido (LN ₂₎ se i livelli di caduta, mentre l'imaging. Questi appunti si farà riferimento come la "schermata di visualizzazione" (Fig. 1c).

2. Preparazione del campione

1. Diluire log cellule di lievito coltivate in fase di sintesi completa (SC) i media a un'adeguata concentrazione di 1x10 ⁶ cellule / ml in acqua.
2. 2 mL del lievito diluito vengono aggiunti su una R2 / 1 400 mesh bucata carbonio rivestito in rame Cryo-EM griglia (Forniture SPI, West Chester, PA) e ha permesso di assorbire per 15 secondi.
3. Blot via il liquido in eccesso dalla superficie della griglia toccando il fondo della griglia per un pezzo di tessuto strappato cellulosa molli (Kimwipe) per 2 secondi.
4. Se necessario, la griglia può essere lavato con 3 ml di gocce d'acqua (1-3 volte), e malvagio via come al punto 3 tamponando dal retro.
5. Prima del lavaggio finale, il campione viene caricato nel congelatore tuffo pneumatico e la griglia impiccagione viene lavato come al punto 2.4. Dopo blotting la griglia con carta velina strappata (Kimwipe) per rimuovere la maggior parte dell'acqua dalla superficie, la griglia è immerso in LN ₂ etano liquido raffreddato e trasferito in una griglia di crio-box per stoccaggio Nota ^1:. È importante lasciare uno strato di liquido più sottile possibile in superficie per mantenere il campione idratata. Impropri blotting si sia asciugare il campione o lasciare ghiaccio che è opaco il fascio di elettroni.

3. Cryo-Light Microscopia

1. Riempire lo stadio criogenico conlN ₂ e subito coprire con la schermata di caricamento (appunti di plastica con solo 1,9 centimetri (3 / 4 ") buco).
2. Una volta che il metallo raggiunge lN ₂ temperatura, trasferire la crio-box attraverso la griglia di 1,9 centimetri (3 / 4 ") buco della schermata di caricamento e il trasferimento in supporto creato dal 3 viti descritto nella parte A5. Svitare la griglia di crio-box dal supporto e rimuovere il supporto per un migliore accesso. Conservare la crio-griglia titolare casella sotto lN ₂ in un dewar separati fino passo 3.10. La griglia di crio-box devono essere tenuti sotto lN ₂ a prevenire griglia di riscaldamento del campione.
3. . Ricarica lN ₂ nella fase criogenico a poco sotto la parte superiore del dissipatore di calore in alluminio Note: lN ₂ livelli devono essere periodicamente controllato e riempito durante il processo di imaging per assicurare lN ₂ è continuamente in contatto con il dissipatore di calore. In generale, la ricarica avviene ogni 10 minuti attraverso la porta di riempire lo schermo.
4. Pre-raffreddare la pinzetta a punta lN _2, quindi trasferire il reticolo (s) sulla superficie piatta visione del dissipatore di calore in alluminio con le pinzette, utilizzando il 1,9 centimetri (3 / 4 ") buco della schermata di caricamento.
5. Muovere con cautela il crio-palco per aperture sotto l'obiettivo del microscopio a luce riflessa è.
6. Posizionare lo schermo trasparente visione in cima alla schermata di caricamento. Poi lentamente togliere la schermata di caricamento facendolo scorrere sotto la visualizzazione sullo schermo. Nota: A questo punto, il campione è più vulnerabile. Tutte le correnti d'aria intorno al microscopio deve essere minimizzata, tra cui: la respirazione, una porta vicino, gente che cammina passato, ecc Consigliamo indossa una maschera o appendere uno schermo trasparente volto sotto il microscopio oculari come misura precauzionale.
7. Ruotare le lenti obiettivo nell'ambiente freddo gas di azoto del crio-stage e scansione per il campione in piano area di visualizzazione dissipatore di calore. Utilizzando le normali brillante luce le tecniche di microscopia campo concentrarsi sulla griglia di partenza con un obiettivo a basso ingrandimento per trovare il centro e scattare una foto panoramica. Specifiche per quanto riguarda le lenti microscopia ottica utilizzata per questo esperimento sono elencati nella sezione Sperimentale Materiali. Nota: LN ₂ non entrare in contatto con le lenti obiettivo e dobbiamo ancora vedere il degrado di immagini o danneggiamento delle lenti dagli effetti del raffreddamento .
8. Focus in alto ingrandimento su un'area di interesse e di acquisire dati con campo chiaro, campo scuro, luce polarizzata o di imaging di fluorescenza. Assicurarsi di registrare la posizione della zona di interesse sui bassi ingrandimenti dell'immagine campo luminoso futuro per la correlazione. Se tutte le precauzioni indicate per il riempimento della lN ₂ sono seguiti, poi la pressione positiva l'azoto evapora è sufficiente per mantenere un ambiente privo di contaminazione (indipendente di umidità ambiente) per la durata di imaging.
9. Una volta terminato, sostituire la schermata di caricamento facendolo scorrere sopra la parte superiore dello schermo. Rimuovere la schermata di visualizzazione rallentando scorrere sotto la schermata di caricamento.
10. Rimuovere la fase di crio dal microscopio e con pre-raffreddata pinzette, trasferire la griglia posteriore al crio-griglia box. Avvitare il crio-griglia titolare box in crio-grid box per sigillare contro l'ambiente e trasferire il supporto a un dewar LN2 per lo stoccaggio e l'imaging futuro.

4. Cryo-Microscopia Elettronica

1. A seguito di tecniche standard e stabilito, caricare la griglia di campione in una Cryo-EM titolare trasferimento mantenendo il provino alla temperatura dell'azoto liquido in ogni momento.
2. Inserire il crio-titolare con griglia campione in un microscopio elettronico a trasmissione.
3. In una visione adatta a basso ingrandimento (50-500x ingrandimento nominale), trovare il centro della griglia campione.
4. Utilizzare i raccolti in precedenza a basso ingrandimento crio-LM dati a partire dal punto 3,7 a determinare l'orientamento relativo di linguette di rame centrale della griglia (come descritto nella Figura 2) e identificare le aree di interesse per l'esatta correlazione.
5. Procedere con l'allineamento microscopio, a basso dosaggio Cryo-EM imaging e raccolta dei dati.

5. Rappresentante Risultati

Lo stadio criogenico (Fig. 1a) è un modo efficace per raccogliere crio-LM dati per crio-microscopio a fluorescenza e analisi cryo-LM/cryo-EM correlativo. La figura 2 mostra come la combinazione di bassa e alta ingrandimento crio-LM immagini consente di creare mappe di riferimento che indirizzarvi verso aree specifiche in Cryo-EM. La risultante crio-LM mappa di riferimento (Fig 2b) è stato utilizzato durante la Cryo-EM di acquisizione dati per individuare le regioni esatto mostrato nella Figura 3.

Figura 1. Stadio criogenico. A) Il layout dello stadio criogenico costituito da una griglia di trasferimento di crio-box montare indicato won una freccia bianca ed un dissipatore di calore in alluminio. Le griglie sono trasferiti sotto lN ₂ dalla crio-griglia di box e posti direttamente sul dell'area di visualizzazione del dissipatore di calore come indicato dalla freccia nera. B) immagine raffigurante lo stadio criogenico con caricamento schermo. Il buco nella schermata di caricamento sia posizionata direttamente sopra la casella di montaggio crio-grid e funge da porta per il trasferimento dei campioni e per la movimentazione dei campioni da crio-griglia casella per l'area campione visualizzazione sul dissipatore di calore con una pinzetta. C) Il criogenico fase in posizione sotto le lenti dell'obiettivo con lo schermo di visualizzazione in posizione. Il ritaglio speciale sullo schermo permette la visualizzazione delle lenti obiettivo di oscillare facilmente in posizione senza spostare lo stadio criogenico. Il foro nella schermata di visualizzazione di distanza dalla zona del campione funge da LN ₂ riempire porta per ricostituire lN ₂ livelli, se necessario.

Figura 2. Navigare in crio-LM per gli studi correlativi. A) a basso ingrandimento crio-LM vista di cellule di lievito aderito a una griglia di esempio. B) La stessa immagine in (a) sovrapposti con una immagine forte ingrandimento fluorescenza di una zona di interesse e con un poligono pieno arancione che segna il centro della griglia campione. Il centro è costituito da un gruppo di quattro piazze, tre hanno una scheda aggiuntiva in metallo e il quarto aperto. Per le tre piazze con la linguetta di metallo in più, due coppie di condividere la scheda sulle assi lungo e corto formando un centro asimmetrico. Questo centro asimmetrico può essere visto in alto a sinistra ed è stato usato per indicare l'angolo di rotazione e la prepotenza della griglia tra crio-LM e Cryo-EM. Da una zone basse immagine ingrandimento molti di interesse possono essere contrassegnati ed usato come una mappa di riferimento per individuare le aree identiche a Cryo-EM. C) Un ingrandita fluorescenza crio-LM immagine dell'area di interesse (b). HTA1-PCP, un C-terminale marcatore CFP istoni, può essere visto come una struttura verde punteggiata di etichettatura la posizione del nucleo. D) Un Cryo-EM immagine dell'area corrispondente (c). Scala bar rappresentano 50 micron.

Figura 3. Correlazione di crio-LM e Cryo-EM. Due campi di vista che rappresentano cellule di lievito identico correlata con crio-brillante campo (a, d), crio-fluorescenza (b, e), e di Cryo-EM (c, f ). scala barre rappresentano il 5 micron.

Discussione

Utilizzando il nostro stadio criogenico e le tecniche di preparazione del campione, gli studi correlativo tra crio-LM e Cryo-EM mostra diversi vantaggi rispetto ai tradizionali approcci temperatura ambiente compreso, ma non limitato a: fissaggio rapido ^1,2, Ridotto photobleaching ³, E la scansione di integrità del campione prima di Cryo-EM ^4,5 O chimiche fissazione / embedding ⁶. Uno dei colli di bottiglia per Cryo-EM la raccolta dei dati è il tempo necessario sia per il trasferimento del campione in un TEM e la scansione della rete per trovare le regioni adatta all'immagine. Con la rapida acquisizione crio-LM dati ⁵, Il tempo dedicato trovare le cellule buone possono essere notevolmente ridotti. Quindi, possiamo risparmiare tempo e denaro e ridurre questo collo di bottiglia da pre-scansione e la mappatura delle aree di interesse crio-LM.

Fasi più costosi o complessi criogeniche possono permettere una risoluzione maggiore crio-LM imaging. Tuttavia, la fase di fabbricato qui è più che sufficiente per molte applicazioni. Se crio-LM imaging e trasferimenti griglia del campione vengono eseguite con cautela, come descritto nel testo e video, completamente le immagini contaminazione libera può essere realizzato. Questo metodo permette correlazione diretta dei dati di microscopia a fluorescenza ed elettronica della cellula stessa, organello o complesso macromolecolare dispersi sul supporto di carbonio o contenuto all'interno di una sezione di tessuto sottile ⁷. Va notato che il valore di questo stadio criogenico si estende oltre cryo-LM/cryo-EM studi correlativo al campo della microscopia ottica nel suo complesso. Questo stadio criogenico è adatto per entrambi i campioni delicati e coloranti fluoroforo / macchie ⁸, Quantum Dots, o proteine ​​fluorescenti tag ⁹ Che può essere instabile durante la fissazione chimica temperatura ambiente e integrazione con paraformaldeide e glutaraldeide. Come risultato, ci auguriamo che questa fase criogenica fornirà un maggiore accesso a chi è interessato a crio-LM, che sono stati precedentemente scoraggiare l'accesso dei costi e insufficiente.

Risoluzione dei problemi Cryo-Light Microscopia

1. Esempio di adsorbimento: Campioni diversi possono presentare caratteristiche di assorbimento variabile al supporto di carbonio. Si può essere necessario utilizzare altri tipi di griglie di supporto come il carbonio continuo, carbonio bucata, o formvar griglie rivestito per il supporto del campione. Inoltre, se il campione è vincolante per le barre di rame della rete e non la superficie in carbonio, potrebbe essere necessario regolare la chimica di superficie di carbonio incubando la griglia con un agente umettante o bagliore scarico prima dell'aggiunta del campione.

2. Fase di stabilità: Se si notano delle vibrazioni, è probabilmente dovuto alla fase campione in sovraccarico di peso, piuttosto che il gorgogliare di LN2. Il peso aggiunto della fase criogenica, a volte può causare vibrazioni a bassa frequenza per trasmettere lungo lo standard a 3 assi fase di apertura microscopio, e incidono negativamente immagini tramite la sfocatura. Questo può essere facilmente corretto sostenendo fase di apertura del microscopio da sotto sia con un mini-regolabile ascensore o un adattatore regolabile con doppia vite di armi, come mostrato nel video. Entrambi questi meccanismi di sostegno regolabile interagire con un non-mobile porzione di palco di viaggio e quindi consenta ancora X e Y traduzione secondo quanto richiesto per l'imaging.

Materiali

Tabella di reagenti e attrezzature specifiche:

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome	Azienda	Catalogo	Commenti	Costo
1-22,86 cm (9 ") pan a torta con bordi inclinati	Cuocere bene		Drogheria locale	4,39 dollari
1-22,86 cm (9 ") tortiera	Cuocere bene		Drogheria locale	4,93 dollari
4 paia di bacchette			Drogheria locale	0,50 dollari
1 - Grande schiuma spray Stuff	Roba grande		Ferramenta locale	5,98 dollari
1 - 4 centimetri x8cm x1cm blocco di alluminio			Ferramenta locale o rottami metallici cantiere	10,00 $
5 - # 10 1,91 centimetri (3 / 4 ") a testa piana con intaglio Bulloni w / dadi			Ferramenta locale	0,98 dollari
3 - # 4 0,95 centimetri (3 / 8 "), l'intaglio bulloni w / dadi			Ferramenta locale	0,98 dollari
15 - # 10 rondelle			Ferramenta locale	0,98 dollari
2 - appunti di plastica trasparente			Ufficio negozio locale	6,84 dollari
1 - Cryo-EM casella della griglia titolare	Ted Pella	160-41		N / A
1 - Cryo-EM casella della griglia asta di movimentazione	Ted Pella	160-46		N / A
1 - R2 / 1 film di carbonio bucata, 400-rete in rame Cryo-EM griglia di supporto	SPI Forniture	4340C-XA		N / A

Materiali sperimentali

1. Ceppo di lievito: Hta1-PCP:: Kan (KSC-3382: Mata, ura3-52, lys2-801, ade2-101, TRP1-Δ63, his3-Δ200, leu2-Δ1, Hta1-CFP:: KanMX6 dal laboratorio Kaplan presso la UC Davis).
2. Cryo-Light Microscopy: Cryo-luce immagini di microscopia sono state scattate in un microscopio Leica DM4000M riflettendo con una Leica DFC310 FX CCD. Campo chiaro, campo scuro e le immagini di fluorescenza sono state acquisite utilizzando un HCX PL FLUOTAR 5x 0,15 NA obiettivo aria, un HCX PL FLUOTAR 10x 0,30 NA obiettivo aria, un PL FLUOTAR 50x 0,55 NA obiettivo di aria o di un NPLAN 100x 0,75 NA obiettivo aria. Campo luminoso e campo scuro immagini utilizzate una lampada da 12V 100W tungsteno come sorgente luminosa. Per fluorescenza, una fonte EL6000 lampada UV è stata utilizzata in combinazione con un JC1 Leica (Ex.F.: BP 480/30, DM: LP 505, SF BP 535/40 e LP 580) Cubo filtro.
3. Cryo-microscopia elettronica a trasmissione: Cryo-EM immagini sono state acquisite su un JEM-2100-FEG Transmission Electron Microscope (JEOL, Giappone) che operano a 200 KeV utilizzando un Gatan 626 crio-transfer titolare (Gatan, USA). Micrografie sono state registrate ad ingrandimenti nominale di X 50, 200, 1.200 e 4.000 su 4.096 x 4.096 pixel Tietz CCD (TVIPS, Gauting, Germania).