Preparazione di adulti Drosophila Occhi di sezionamento sottile e analisi microscopica

Sommario

Un approccio standard per la preparazione degli adulti Drosophila Gli occhi semi-sottile e leggero sezionamento analisi microscopica è presentato qui. Il protocollo può essere utilizzato per lordo analisi morfologica di difetti dell'occhio, o con le modifiche indicate possono essere utilizzati per determinare i requisiti genetica dei geni in tipi cellulari specifici degli occhi (ad esempio l'analisi clonale dei fotorecettori) o per analisi al microscopio elettronico.

Abstract

Drosophila è stato a lungo utilizzato come sistema modello per studiare lo sviluppo, principalmente a causa della facilità con cui è geneticamente trattabili. Nel corso degli anni, una pletora di ceppi mutanti e trucchi tecnici sono stati sviluppati per permettere domande sofisticate per essere chiesto e ha risposto in un ragionevole lasso di tempo. Intuizione fondamentale nella interazione dei componenti di tutte le note principali vie di segnalazione sono state ottenute in avanti e indietro studi di genetica della Drosophila. L'occhio vola ha dimostrato di essere particolarmente adatto per l'analisi mutazionale, dal momento che, in condizioni di laboratorio, le mosche possono sopravvivere senza gli occhi funzionali. Inoltre, la superficie degli occhi degli insetti è composto da circa 800 occhi singola unità (faccette o ommatidi) che formano una regolare, liscia, visto sotto un microscopio da dissezione. Così, è facile vedere se una mutazione potrebbe influenzare lo sviluppo degli occhi o la crescita di esternamente alla ricerca per la perdita della superficie liscia (fenotipo 'occhio grezzi'; Fig. 1.) O la dimensione complessiva degli occhi, rispettivamente (per gli esempi di schermi basati su morfologia occhio esterno si veda ad esempio ^1). Successive analisi dettagliate dei fenotipi occhio richiedono fissazione, di inclusione e sottile sezionamento degli occhi adulti.

L'occhio di Drosophila sviluppa dal cosiddetto disco occhio immaginale, un sacco di cellule epiteliali che proliferano e si differenziano durante le fasi larvali e pupa (per una rassegna si veda ad esempio ^2). Ogni ommatidium costituito da 20 celle, tra cui otto fotorecettori (PR o R-cellule;. Fig. 2), quattro lenti che secernono coni, le cellule del pigmento ('esagono' intorno a R-cell cluster) e una setola. I fotorecettori di ogni ommatidium, più facilmente identificati dai loro organelli sensibile alla luce, la rhabdomeres, sono organizzati in un trapezio formato da sei "esterno" (R1-6) e due "interiore" fotorecettori (R7 / 8; R8 [Fig. . 2] è sotto R7 e quindi visto solo nelle sezioni da zone più profonde degli occhi). Il trapezio di ogni sfaccettatura è proprio in linea con quelli dei suoi vicini e gli assi antero-posteriore e dorsoventrale complessivo dell'occhio (Fig. 3A). In particolare, il ommatidi della dorsale e ventrale (frecce nere e rosso, rispettivamente) metà degli occhi sono immagini speculari l'uno dell'altro e corrispondono a due forme chirali stabilito durante la segnalazione di polarità planare delle cellule (per una rassegna si veda ad esempio ^3).

Il metodo per generare semi-sottili sezioni occhio (come quelli presentati in fig. 3) descritto qui è leggermente modificato rispetto a quello originariamente descritto da Tomlinson e Ready ^4. Consente l'analisi morfologica di tutte le cellule tranne le cellule cono trasparente. Inoltre, il pigmento di R-cellule (punte di freccia blu in fig. 2 e 3) può essere usato come una cellula-autonomo marcatore per il genotipo di un R-cell, i requisiti così genetica dei geni in un sottogruppo di R-cellule possono essere facilmente determinata ^5,6.

Protocollo

1. Vola dissezione testa

1. Assicurarsi di avere tutti i materiali a portata di mano (compresi gelatina vetrini rivestiti). Preparare glutaraldeide e fissativi osmio (vedi sotto). Per genotipo di inserire, aliquota 200μl soluzione fissare glutaraldeide in provette da 1,5 ml su ghiaccio.
2. Anestetizzare vola sul CO ₂ pad (che di solito sezionare sette teste volare a incorporare sei per genotipo nel caso in cui una testa è distrutto durante la procedura).
3. Attesa e premete leggermente il torace del lato volare, dorsale alto, con le pinzette e utilizzare un bisturi affilato per tagliare la testa.
4. Stabilizzare la testa vola toccando il collo con le pinzette e con attenzione fetta fuori una piccola parte di un occhio. Questo aumenta la penetrazione del fissativo (se si intende utilizzare le sezioni occhio per l'analisi clonale, tagliare l'occhio con cloni senza o meno). Evitare di toccare e di danneggiare l'occhio intatto, che sarà poi sezionato.
5. Toccare la testina con le pinzette o il bisturi sulla superficie del cut off e trasferimento occhio della testa in glutaraldeide / fosfato fissativo su ghiaccio (le teste spesso galleggiante sopra il fissativo) Le teste dissezionato non dovrebbero essere tenuti in glutaraldeide fissare più a lungo di 15 minuti prima l'aggiunta di osmio. Ripetere i passaggi 1,2-1,5 con le mosche che altri lo stesso genotipo.

2. Fissazione e di inclusione (utilizzo di guanti per tutte le fasi!)

1. Gira la flyheads in centrifuga Eppendorf per 1 minuto a 10.000 giri. Continua anche se il capo non affondare.
2. Aggiungere 200μl di OsO ₄ soluzione e fissare per almeno 30 minuti e fino a 1 ora su ghiaccio.
3. Utilizzando una pipetta Pasteur, rimuovere la glutaraldeide / osmio soluzione (assicurarsi di utilizzare le corrette procedure di smaltimento dei rifiuti!) E sostituirlo con una soluzione di osmio 200μl. Incubare in ghiaccio per 1-6 ore. Assicurarsi sempre le teste sono completamente ricoperto di liquido e mai rimuovere tutta la soluzione come la testa o gli occhi potrebbe crollare!
4. Utilizzando una pipetta Pasteur, scartare fissativo, aggiungere 0,5-1ml 30% etanolo e incubare per almeno 5 minuti in ghiaccio (assicurarsi di utilizzare correttamente le procedure di smaltimento dei rifiuti in quanto l'etanolo contiene ora osmio!).
5. Ripetere la stessa operazione con il 50%, 70%, (80%), il 90% e due volte di etanolo al 100%. Includere il passo etanolo all'80% se si utilizzano gli occhi per l'analisi al microscopio elettronico. Dopo la fase di lavaggio del 70%, i campioni possono essere rimossi dal ghiaccio.
6. Sostituire l'etanolo con un uguale volume di ossido di propilene (volatili, continuano a lavorare nel cappuccio). Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
7. Ripetere ossido di propilene lavare. Lavoro in batch in caso di trattamento genotipi in parallelo per evitare collasso degli occhi a causa dell'evaporazione di ossido di propilene.
8. Eliminare la maggior parte di ossido di propilene e l'utilizzo di una pipetta di plastica trasferimento, aggiungere circa 500μl di un 1:1 in resina: soluzione di ossido di propilene. Equilibrare la notte a temperatura ambiente.

3. Incorporare e disposizione in stampi

1. Assicurarsi che tutti gli stampi sono etichettati in modo da tenere traccia delle differenti genotipi, quindi riempire gli stampi con il 100% resina. Non riempire troppo (no 'alte colline' su tutta la superficie degli stampi, quando guardando dritto su tutta la superficie dello stampo). Usa resina dura per l'analisi EM.
2. Usando una pipetta di trasferimento, togliere la resina 50% dal teste, sostituire con il 100% di resina, e incubare per 3-4 ore a temperatura ambiente. Come teste sono infiltrati con la resina, essi si depositano sul fondo della provetta.
3. Utilizzando uno stuzzicadenti che è stato colpito su una superficie dura, una volta per creare un gancetto, una testa di trasferimento al momento in uno stampo.
4. Posizionare un foglio di alluminio sulla zona di lavoro della vostra portata dissezione per la protezione contro le fuoriuscite di resina.
5. Utilizzando un ago da dissezione e guardando se il vostro scopo, agitare la testa leggermente nella resina e con attenzione si sposta verso il fondo dello stampo vicino l'estremità appuntita.
6. Allineare con cura la superficie del intatta (!) Occhio (o il vostro aereo future sezionamento se si vuole avere sezioni) collo in giù con la parete frontale dello stampo, avendo cura di mantenere la superficie tangenziale dell'occhio circa la metà a testa diametro di distanza dalla parete dello stampo. In rari casi, un occhio che crolla può essere visto come uno spazio vuoto tra la superficie dell'occhio e la cuticola testa. Se avete un occhio crollato, sostituirlo con l'occhio 7 ^° di ricambio.
7. Ripetere con tutte le teste. Una volta fatto con tutti i tracciati, ricontrollare tutti gli occhi per assicurarsi che non si muove quando è stato rimosso l'ago della resina.
8. Se avete problemi con occhi che si muovono quando si rimuove l'ago dissezione, posizionare l'occhio come desiderato, in modo rapido ritrarre l'ago un po 'lontano dalla testa e si estrae quindi lentamente l'ago completamente.
9. Cuocere gli stampi durante la notte a 70 ° C.

4. Rifilatura e di sezionamento

1. Rimuovere i blocchi indurito dagli stampi piegando gli stampi, keeping traccia di quale blocco corrisponde a quale genotipo (ad esempio, memorizzare in fiale di scintillazione di piccole dimensioni).
2. Per il taglio, utilizzare un mandrino appropriato per il microtomo che è montato a faccia in su un blocco di plexiglas o alluminio. Montare il blocco di tagliare, gli occhi in su, nel mandrino.
3. Nell'ambito di applicazione dissezione con un rasoio rivestiti in Teflon ordinò, accuratamente tagliato fuori solo lo strato superiore del blocco. Questo lascerà una superficie trasparente attraverso la quale si dovrebbe vedere l'occhio e può quindi prevedere il piano futuro di sezionamento. Evitare di tagliare le dita!
4. Tagliare l'eccesso di plastica su entrambi i lati della testa e sulla parte anteriore (cioè quella che era la parte superiore dello stampo quando si allinea gli occhi) finché la maggior parte della plastica intorno alla testa è tagliata. E 'meglio per avvicinarsi lentamente alla testa da tagliare più sottili strati di plastica.
5. Utilizzando una lama di rasoio pulito, rimuovere con attenzione strati sottili dalla parte superiore dell'occhio nel piano esatto volete sezione successiva (di solito tangenzialmente ad occhio, con una leggera angolazione verso la superficie dello stampo originale).
6. Continuare fino a poco iniziano a tagliare la superficie esterna dell'occhio. Assicurarsi di utilizzare aree pulite della lama per ottenere una superficie lucida e trasparente, che rende più facile allineamento nel microtomo.
7. Per risparmiare sulle lame di rasoio, usare vecchie lame per il taglio greggio intorno ai lati del blocco e l'uso di una lama fresca per il taglio sottile (primo taglio e 4.6). Alla fine si avrà una piramide su tre lati con un po 'inclinato, cut-off superiore che corrisponde al piano di sezione futuro.
8. Montare il blocco nel microtomo. Sezionamento effettiva varia a seconda del tipo di microtomo e non saranno descritte in dettaglio qui. Usiamo un Sorvall MT5000 con un coltello di diamante di qualità isto di tagliare 0,5 a 1μm sezioni. Per la luce analisi al microscopio, lievi variazioni di spessore sezione non importa. Se cloni sezionamento segnato da un bianco + transgene, sezione 1μm sezioni per assicurare di avere granuli di pigmento abbastanza adiacente alla rhabdomeres per sezione (Fig. 2).
9. Sezioni galleggia sull'acqua. Sollevare primi 20-30 sezioni con una punta schiacciata di legno Q-tip da sotto la superficie dell'acqua in un movimento di rotazione e trasferirli in una goccia d'acqua su un vetrino da gelatina vetro rivestito (tenuto su una piastra di riscaldamento a circa 100 ° C ).
10. Ripetere con altri 20-30 sezioni. Attendere fino a quando l'acqua è evaporata e sezioni bastone alla diapositiva. Di solito, le sezioni di 3 occhi disposti in tre colonne (tre occhi) da filari twp (alto / basso sezioni) si adattano bene su una diapositiva.

5. Colorazione e analisi al microscopio

1. A meno che cloni di sezionamento, sezioni macchia. Porre il vetrino con sezioni su un blocco di riscaldamento a 90 ° C. Dispensare toluidina-blu soluzione colorante da una siringa da 30 ml collegata ad un filtro 0.22μm sul vetrino e macchia per 10 secondi. Sciacquare immediatamente a lungo con acqua distillata. Asciugare all'aria.
2. Utilizzando una pipetta di plastica trasferire, distribuire 3 gocce di DPX montaggio medio sul vetrino e coprire con un coprioggetto. Top con 3 monetine e lasciare che il montaggio di media indurire (per esempio durante la notte a temperatura ambiente).
3. Immagine con un microscopio ottico. Utilizzare una lente 5x o 10x per trovare una buona sezione e quindi passare a una lente 63x immersione in olio per l'analisi dettagliata e fotografare. Noi di solito utilizzare le impostazioni di contrasto di fase, campo scuro ma l'ottica funziona altrettanto bene.

6. Rappresentante dei risultati:

Il più delle volte, gli occhi sono incorporate in plastica per una dettagliata analisi dei fenotipi esterno dell'occhio rough rilevato come parte di uno screening genetico o in fase di test interazioni genetiche con geni noti per influenzare sia la struttura generale degli occhi o polarità. Risultati tipici di sezioni occhio sono mostrati in Figura 3. Wild-type ommatidi (Fig. 3A) mostrano la serie completa dei fotorecettori circondata da un reticolo di cellule del pigmento. Al contrario, in un strabismo (stbm, alias van ^gogh-7) mutante, la polarità ommatidial si perde e, anche se il complemento fotorecettore completo è presente, la rotazione e la chiralità sono randomizzati (Fig. 3B). Inoltre, poiché l'allele stbm è stato sezionato in aw ^- sfondo, i granuli di pigmento sono mancanti in fig. 3B. Figura 3C mostra un esempio di analisi clonale. Drosophila Rho-chinasi (drok) è necessario per la rotazione ommatidial nonché per l'integrità strutturale dell'occhio ^8. Omozigote drok ² cloni possono essere identificate per l'assenza di pigmento nelle cellule del pigmento e la rhabdomeres (tipicamente, i cloni sono indotte usando senza occhi-FLP e un P-elemento con un gene marcatore fortemente espresso bianco a complemento di w sfondo ^- mutazione allo stato brado tipo e tessuto eterozigote). E 'così possibile identificare le aree mutante dalla mancanza di pigmento. A causa della cellula-autonomia della pigmentazione nel gruppo R-ceLLS accennato in precedenza, genotipi dei singoli R-cellule possono essere determinato (vedi punte di freccia in fig. 3C).

Figura 1. Drosophila L'occhio è un sistema eccellente modello per i biologi in quanto, in contrasto con la superficie liscia di una wild-type occhio (A), la superficie di un occhio mutante esternamente è spesso approssimativa (B), indicativo di fenotipi occhio sottostante . In tutte le figure, è anteriore a sinistra e dorsale è alto. Immagini gentilmente concesse da Dr. Jennifer Curtiss, NMSU, Las Cruces, NM, USA.

Figura 2. Luce immagini microscopiche dei singoli ommatidi sezionato con il metodo descritto. Solo sette R-cellule sono visibili in un momento per ommatidium, dal momento che R7 si trova in cima R8. (A, A ') A livello R7, il corpo cellulare di R7 viene rilevato tra R1 e R6 (freccia gialla in A'). Al contrario, a livello R8 (B), il corpo cellulare di R8 si rileva tra R1 e R2 (freccia gialla in B '). Punte di freccia blu segnano i granuli di pigmento che può essere usato come una cellula-autonomo marcatore pigmento.

Figura 3. Sezioni tangenziale attraverso wild-type (A), stbm (B) e drok (C) mutanti adulti occhi di Drosophila. Schemi sotto le sezioni indicano la polarità di ommatidi (vedi (A) per le frecce). Cerchi rappresentano ommatidi con difetti nel complemento di fotorecettori. Linee gialle rappresentano la linea dorsale / ventrale di simmetria (equatore). In contrasto con la ben orientata ommatidi di wild-type (A), l'organizzazione planare si perde nella mutante stbm (B). Si noti che la sezione del mutante stbm mostrato manca di pigmento per la sua w ^- sfondo mutante. (C) Perché drok mutazioni sono letali, devono essere analizzate in cloni. Così, le cellule pigmentate sono wild-type o eterozigoti (riempito punte di freccia blu), mentre la R-cellule del pigmento manca (aperto punte di freccia blu) sono omozigoti mutanti. Oltre a difetti di rotazione, i mutanti drok mostrano anche difetti strutturali compresi i numeri mancanti o in eccesso di R-cellule. Si noti che per l'analisi clonale, le sezioni non sono macchiate di evitare oscurando i granuli di pigmento.

Discussione

Utilizzando Drosophila come organismo modello, schermi genetica ha portato all'identificazione di molti dei membri fondatori di famiglie di geni essenziali per la maggior parte delle vie di segnalazione altamente conservata in eucarioti superiori inclusi gli esseri umani. Dal momento che, in condizioni di laboratorio, un occhio funzionale è dispensabile per la sopravvivenza, l'occhio è un tessuto particolarmente adatto per la scoperta delle funzioni nuovo gene e la valutazione delle reti genetiche. Analisi ultrastrutturale dell'occhio volo usando il metodo descritto così portato a scoperte fondamentali rilevanti per lo sviluppo e la malattia. Inizialmente, l'analisi singola cellula clonale è stata effettuata utilizzando raggi X cloni indotti combinato con nota strettamente associata marcatori recessiva cellule autonome. Più recentemente, la disponibilità del FLP / FRT sistema per generare cloni ha notevolmente facilitato l'analisi fenotipica delle mutazioni letali nelle sezioni occhi ^6,9.

Analisi delle sezioni occhio non è limitato alle sezioni tangenziali descritto qui. Se lo si desidera, le teste possono essere allineati in qualsiasi orientamento negli stampi e le sezioni trasversali possono essere ottenuti per studiare strati più profondi nella testa, come la lamina e midollo. Il protocollo qui descritto è quindi un metodo versatile per l'analisi delle strutture oculari e della testa Drosophila adulti.

Materiali

Attrezzature generiche:

• Per l'allevamento volare generale vedi ¹⁰
• Dissezione microscopio standard (ad esempio Nikon SMZ-645 Zoom Stereo Microscope), con una sorgente di luce ad anello per evitare che un'ombra delle tue mani.
• CO ₂ pad Fly, coperto con carta Whatman 3MM per fornire una protezione contro lo sporco durante la dissezione.
• Gelatina vetrini rivestiti: sciogliere 10 g di gelatina e 1g CrKSO ₄ x 12 H ₂ O in acqua 1L su una piastra di riscaldamento (portare quasi a ebollizione, dura circa 2 ore). Immergere i vetrini ben lavati (sapone) e risciacquati (dH ₂ O) in porta in soluzione di gelatina e asciugare coperti con un foglio di notte.
• Forno di riscaldamento (70 ° C; forni a vuoto vecchi che sono stati utilizzati per l'asciugatura del filtro di nitrocellulosa sono adatte per questo scopo).
• Capace di sezionamento ultrasottili (0.5-1 sezioni micron di spessore) microtomo, ad esempio quelli utilizzati dalle strutture di microscopia elettronica. Usiamo un Sorvall MT5000 Ultramicrotomo con un coltello di diamante di qualità Histo. Coltelli di vetro anche di lavoro.

Fissazione soluzioni:

• Preparare una soluzione madre di 0,2 M tampone fosfato di sodio, pH 7,2.
• Preparare il 2% glutaraldeide in tampone di fosfato di sodio 0,1 M, pH 7,2 (può essere conservato a 4 ° C per 4 settimane). Fare almeno abbastanza per avere 200μl per genotipo si desidera incorporare. Tenere su ghiaccio.
• Osmio soluzione: 2 OsO _4% in tampone fosfato di sodio 0,1 M, pH 7,2. Fare solo quanto basta per avere 200μl per genotipo si desidera incorporare, dal momento che la soluzione non può essere memorizzato. Tenere su ghiaccio.

E glutaraldeide OsO ₄ sono altamente tossici e devono essere maneggiati con estrema cura in una cappa ben ventilata. Utilizzare puntali con filtro quando si maneggia OsO ₄ per evitare l'annerimento della vostra pipetta.

Disidratazione: Fai 30%, 50%, 70%, (80%), il 90%, e le soluzioni di etanolo al 100%. Preferibilmente fresco 30%, 50%, 70% di etanolo sul ghiaccio prima dell'uso.

Soluzione colorante:

1% toluidina-blu 1% borace.

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
	Morbido	Difficile
Una resina	54g	50g
Indurente B	44.5g	50g
Acceleratore C	2.5g	1.75g
Plastificante D	10g	0,75 g

Tabella 1. Resina preparazione

Per preparare la resina, con attenzione, ma mescolare bene tutti gli ingredienti in un bicchiere di plastica con un agitatore magnetico con ancoretta di grandi dimensioni. Evitare bolle. Dopo la miscelazione, aliquota in fiale di scintillazione standard o contenitori simili e congelare a -20 ° C. Usa resina morbida per tutte le applicazioni meno che il vostro impianto di EM chiede la formulazione più dura. Usare i guanti per maneggiare resina (cancerogeno nella sua forma non polimerizzato). Per polimerizzare resina su attrezzature e rifiuti, cuocere in forno a 70 ° C durante la notte. Rifiuti può quindi essere tranquillamente eliminate e attrezzature pulito e riutilizzato. Versato in resina non polimerizzato può essere pulito con isopropanolo.

Reagente	Fornitore	Numero di catalogo
Fly Pad	ad esempio Genesee	59-119
Glutaraldeide	Sigma	G7526-10 X 10 ML
OsO 4	Polysciences, Inc.	0972A-20
Propyleneoxide	Pescatore	04332-1
Maniglie bisturi, per # 3	Pescatore	22080046
Lame di bisturi # 11	Pescatore	08-916-5B
Trasferimento di pipette	Pescatore	13-711-7M
Durcupan (R) ACM resina	Sigma (Fluka)	44610-1EA
Acciaio ago dissezione	Pescatore	S17346
Beem stampo embedding piatto	Microscopia Elettronica Fantascienza.	70904-12
Lame di rasoio Teflon	Microscopia Elettronica Fantascienza.	71970
Q-tip (tamponi sterili)	Pescatore	14-959-81
Vetrini	Pescatore	12-550-143
Coprioggetto n. 1, 22x60 millimetri	Pescatore	12-531K
Gelatina	Pescatore	ICN96010280
Cr (III) K SO 4 dodecaidrato	Sigma	243361
Diamante Histo coltello, 6mm	Diatome Stati Uniti	60-La sua
Blu toluidina O	Pescatore	BP107-10
Borace (Na-tetraborato)	Pescatore	AC20629-1000
DPX montaggio medio	Sigma	44581-100ML

Tabella 2. Materiale