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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Crea un modello di topo simile alla PCOS
NOTA: I topi utilizzati in questo studio erano a fondo misto (C57/B6, CD1, 129Sv) e sono stati mantenuti con cibo e acqua ad libitum in un ciclo luce/buio di 14/10 ore a 24 °C.
- Preparazione del pellet DHT
- Tubo silastico in autoclave per sterilizzare. Tagliare i tubi silastici a una lunghezza di 15 mm con una lama di rasoio.
- Sigillare un lato iniettando silicone adesivo medicale nella provetta con un ago smussato da 20 G collegato a una siringa da 3 ml. Lo stantuffo deve essere estratto dalla siringa e quindi inserito con l'adesivo nel serbatoio. Lo stantuffo viene reinserito e l'adesivo viene spinto verso il basso fino a quando non inizia a fuoriuscire dall'ago. L'ago smussato è realizzato tagliando il lato affilato della punta dell'ago da 20 G con qualsiasi forbice forte. La lunghezza del silicone nel tubo deve essere superiore a 2 mm per consentire il taglio in post-produzione.
- Asciugare per una notte; verificare la presenza di bolle d'aria sul lato sigillato. Quelli senza bolle d'aria vengono utilizzati per i pellet DHT. Altri possono essere utilizzati per pellet di controllo senza DHT.
- Indossare guanti, maschera, occhiali e camice da laboratorio prima di preparare il pellet DHT in un cappuccio per evitare l'esposizione al DHT sulla pelle.
- Versare la polvere di DHT in una bilancia di plastica e premere il lato aperto dei tubi con tappo adesivo (prodotti in 1.1.1) nella polvere di DHT.
- La polvere di DHT può essere pressata con una grossa graffetta che viene raddrizzata. Continuare fino a quando il DHT non raggiunge un'altezza di 4 mm (o la lunghezza desiderata). Controllare la lunghezza del DHT con un righello e sigillare il lato aperto con silicone, asciugare per una notte.
- Tagliare ogni lato sigillato per ottenere una lunghezza di 2 mm di silicone. La lunghezza totale del pellet sarà di 8 mm.
- Sigillare entrambi i lati del tubo silastico vuoto come pellet di controllo (no-DHT).
- Conservare i pellet in una provetta conica da 50 ml avvolta con un foglio di alluminio (per evitare l'esposizione alla luce) a temperatura ambiente fino al momento dell'uso. I pellet DHT mantengono la piena efficacia per almeno 3 mesi di conservazione.
- Inserimento e sostituzione DHT
- Fino a 20 pellet di DHT o pellet di controllo vengono immersi separatamente in una provetta conica da 50 mL con 30 mL di soluzione fisiologica sterile allo 0,9% per 24 ore a 37 °C per l'equilibratura appena prima dell'inserimento.
- Prima dell'intervento chirurgico, le superfici e i guanti vengono disinfettati con clidox e le superfici di lavoro vengono ricoperte con carta assorbente pulita con supporto in plastica (tampone chirurgico). Tutti gli strumenti che vengono a contatto con gli animali vengono decontaminati prima di entrare nella struttura per animali mediante sterilizzazione in autoclave. Gli strumenti saranno lasciati asciugare e raffreddare prima dell'uso.
- Vengono utilizzati topi femmine di 2 mesi (4-5 topi/gabbia). I topi vengono iniettati per via intraperitoneale con xilazina (3,5 mg/kg di peso corporeo) e ketamina (78,8 mg/kg di peso corporeo) utilizzando una siringa da insulina. I calcoli per la miscelazione e il dosaggio dell'anestesia sono riportati nella Tabella 1.
- Dopo aver ottenuto un'adeguata anestesia, misurata dalla perdita del riflesso delle dita dei piedi e dalla respirazione rallentata, il topo verrà preparato per l'intervento chirurgico.
- Disinfettare la pelle dell'area con betadine utilizzando una garza sterile e pulirla con etanolo al 70%. L'area sarà nuovamente dipinta con betadine.
- Praticare un foro di circa 5 mm di lunghezza con le forbici sotto la pelle vicino al collo. Utilizzando un trochar da 10 G, praticare un piccolo tunnel (15 mm) in direzione rostrale. Il pellet viene inserito dorsalmente con il trochar.
- L'apertura viene quindi sigillata con adesivo chirurgico. Approssimare manualmente i bordi della ferita con una pinza e delicati movimenti di spazzolatura per applicare un sottile film di adesivo liquido sui bordi approssimati della ferita. Accumulare 3 strati sottili di adesivo per garantire che l'adesivo sia distribuito uniformemente sulla ferita. L'adesivo deve estendersi di 1 cm su ciascun lato dei bordi della ferita apposti. Per chiudere il foro è possibile utilizzare anche clip di sutura o chirurgiche. Rimetti i topi in gabbia, alloggiati individualmente, con un cuscinetto termico per il recupero. Sostituire il pellet ogni 4 settimane per mantenere un livello costante di esposizione agli androgeni. Il pellet originale verrà rimosso e il nuovo pellet verrà inserito come descritto sopra, in una posizione simile.
| Ketamina
(100 mg/mL)
| Xilazina
(100 mg/mL)
| salino
(0.9%)
|
| 175 μl | 15 μl | 810 μl |
| Iniezione intraperitoneale della soluzione di lavoro: 0.1 mL/20g peso corporeo |
Tabella 1. Cocktail di ketamina/xilazina.