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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Alloggio di base dei topi
- Ospita i topi in gabbie di plastica con fondo e lati solidi e uno strato di lettiera morbida e materiale di nidificazione come la triturazione della carta. Usa una lettiera composta da pannocchie di mais sminuzzate o trucioli di legno e assicurati che la lettiera venga cambiata regolarmente per l'igiene.
- Fornire accesso al cibo e all'acqua ad libitum. La parte superiore della gabbia di plastica ospita una tramoggia per il cibo. Erogare pellet di cibo per topi correttamente formulati dalla tramoggia del cibo e fornire un distributore d'acqua. Assicurati che la parte superiore della gabbia sia dotata di un filtro dell'aria per proteggere i topi dai contaminanti esterni.
- Mantenere i ritmi circadiani naturali dei topi seguendo un ciclo luce-buio di 12 ore nella struttura di stabulazione. Condurre test comportamentali alla stessa ora del giorno, idealmente durante il ciclo di buio dell'animale, ad esempio durante le ore serali.
nota: Bisogna fare attenzione a distinguere i topi nell'alloggiamento. Sono disponibili vari metodi per distinguere i topi, come punzoni per le orecchie, marchi auricolari e segni sulla coda.
2. Test del labirinto di Barnes: Costruzione
- Procuratevi una tavola di legno circolare di 120 cm di diametro.
- Taglia 20 fori circolari (4,5 cm di diametro) attorno al perimetro del cerchio. Posizionare ogni foro in modo che si trovi a 2,5 cm di distanza dal bordo del labirinto e a 13 cm di distanza dai fori adiacenti.
- Lisciare le superfici e dipingerle di bianco lucido (si consiglia un colore brillante).
- Designare un lato del labirinto per l'inserimento di piccoli ganci a tazza a circa 2-3 cm di distanza da ciascuno dei 20 fori e posizionare due ganci per ogni foro (uno su entrambi i lati di ciascun foro).
- Utilizzare dischi neri (di plastica) poco profondi per coprire i buchi sul lato del labirinto con ganci. Usa i ganci per fissare gli elastici spessi in modo da tenere i dischi sul fondo del labirinto.
- Monta in modo sicuro il labirinto Barnes a 120 cm dal suolo e lontano da altri oggetti altrettanto alti come tavoli o sedie. Una scatola o uno sgabello possono essere utilizzati per sostenere il centro del labirinto.
- Posiziona grandi poster bianchi con una forma su ogni parete (triangolo, cerchio e croce) come spunti extra-labirinto su 3 lati del labirinto. Mantieni i poster sulle pareti intorno al labirinto per ogni prova.
- Sull'ultimo lato del labirinto, è stato allestito un solido sipario nero per nascondere gli osservatori in modo che i dati possano essere registrati con precisione senza che i ricercatori siano visibili ai topi sul labirinto.
- Sospendi una videocamera sopra l'arena con una vista a volo d'uccello dell'intera superficie del labirinto.
- Pulisci ogni superficie del labirinto (dischi neri e scatola di destinazione inclusi) con acqua, quindi una soluzione di etanolo al 70% prima e dopo ogni prova sui topi.
- Posiziona una fonte di luce da 100 W a 25 cm sopra il centro del labirinto (accendi/spegni all'inizio/fine della prova) e assicurati di avere i dischi e i ganci rivolti verso il pavimento.
nota: Tutte le altre plafoniere nella stanza devono essere spente durante il test. Si consiglia l'aggiunta di un generatore di rumore a ultrasuoni appeso accanto a una luce da 100 W. Attivalo/disattivalo all'inizio/alla fine di ogni prova.
3. Test del labirinto di Barnes: procedura
NOTA: Assicurati che tutti i componenti del labirinto siano puliti con acqua e soluzione di etanolo al 70% prima e dopo ogni prova, lasciando che il tempo si asciughi completamente prima che i test riprendano. Assicurati di avere a portata di mano i prodotti per la pulizia e i timer per le prove.
- Alloggia tutti i topi in gruppi utilizzando un metodo di identificazione affidabile. Tieni i topi fuori dalla sala prove quando non stanno correndo attivamente nel labirinto. Questo per garantire che non siano sottoposti prematuramente al rumoroso ultrasonico.
- Maneggia i topi raccogliendoli delicatamente e tenendoli dalla base della coda, con le zampe tenute sulla mano.
- Per l'addestramento, fai correre i topi sul labirinto ogni giorno una volta al giorno per 7 giorni consecutivi per valutare l'apprendimento/acquisizione><.
nota: Un singolo studio a lungo termine può essere fatto in un secondo momento per valutare la memoria/ritenzione. L'attuale protocollo ha addestrato topi adolescenti a partire dal 32° giorno postnatale e uno studio a lungo termine è stato eseguito su adulti di 4 mesi di età.
- Assegna casualmente ogni mouse a un foro di destinazione da utilizzare durante il periodo di test. I fori possono essere etichettati da 1 a 20 sul fondo del labirinto o all'esterno del perimetro del labirinto, dove non sono visibili al topo nel labirinto.
- Sostituire il disco forato assegnato con una piccola scatola nera (23 x 11 cm). Fissalo saldamente al labirinto di Barnes utilizzando degli elastici collegati ai ganci più vicini.
nota: La scatola di destinazione è abbastanza bassa da consentire al mouse di entrarvi facilmente o contiene un gradino per garantire che il mouse non debba saltare al suo interno.
- Posiziona il mouse al centro del labirinto sotto una tazza per acclimatarti per 30 secondi fino all'inizio del test. Inizia la registrazione video.
- Accendi la luce e il rumovero ultrasonico. Sollevare la tazza tramite un meccanismo a corda per evitare di distorcere la direzione iniziale dell'animale. Avvia un timer e siediti dietro la tenda per osservare.
- Dopo che il mouse è entrato nel foro di destinazione, coprire il foro con la stessa tazza opaca utilizzata all'inizio della prova o con un legante e spegnere il rumoroso a ultrasuoni. Se il mouse non è entrato nel bersaglio dopo che sono trascorsi 5 minuti, rinchiudi il mouse nel foro del bersaglio.
- Assicurati che il mouse entri nel foro. Quando il mouse è all'interno della scatola di destinazione, coprire il foro e spegnere il rumista. Lascia che il mouse rimanga nella casella di destinazione per 1 minuto indisturbato.
- Sebbene il foro di destinazione rimanga costante per ogni topo durante il periodo di addestramento, esegui i topi in ordine casuale ogni giorno per assicurarti che non stiano seguendo alcun segnale/profumo lasciato dal topo precedente.