Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Induzione SE
- Acquista topi maschi C57BL/6NHsd di 8 settimane e pesa ogni topo. Quindi, usa un pennarello per contrassegnare le code di tutti i topi per una facile identificazione durante l'induzione SE.
- Calcolare la quantità di scopolamina bromuro di metile (scopolamina; 2 mg/kg), terbutalina emisolfato (terbutalina; 2 mg/kg) e pilocarpina cloridrato (pilocarpina; 280 mg/kg) in base al peso del topo e aggiungere soluzione fisiologica (0,9% NaCl, 10 ml/kg) per preparare soluzioni.
NOTA: Ad esempio, se il peso del topo è di 25 g, vengono applicate le seguenti quantità: scopolamina e terbutalina: 2 mg/kg * (25 g/1.000 g) = 0,05 mg, Soluzione salina: 10 ml/kg * (25 g/1.000 g) = 0,25 ml, pilocarpina: 280 mg/kg * (25 g/1.000 g) = 7 mg, soluzione fisiologica: 10 ml/kg * (25 g/1.000 g) = 0,25 ml.
- Caricare la miscela di scopolamina e terbutalina in una siringa da 1 ml con un ago da 30 G. Iniettare la soluzione per via intraperitoneale in ciascun topo, quindi riportare i topi nelle loro gabbie. A 30 minuti dalla somministrazione di scopolamina e terbutalina, iniettare la soluzione di pilocarpina in ciascun topo (i.p.; siringa da 1 ml; ago da 30 G). Immediatamente dopo l'iniezione di pilocarpina, mettere i topi in un'incubatrice (28-30°C) per l'osservazione.
- Monitorare attentamente il comportamento dei topi fino a quando non viene indotta la SE. Se vengono rilevate crisi motorie limbiche che corrispondono allo stadio 3 o superiore secondo la scala di Racine, registrare l'ora e monitorare i topi per determinare se le crisi si verificano più frequentemente. Una volta che le crisi motorie continue durano più di 2 minuti, posizionare il topo in una nuova gabbia a temperatura ambiente e continuare a monitorare per 3 ore per determinare se le crisi convulsive continuano e se la SE è indotta. Eutanasia dei topi che non sono riusciti ad entrare in SE a circa 2 ore dopo l'iniezione di pilocarpina.
NOTA: Scala di Racine; fase 1, movimento della bocca e del viso; fase 2, annuisce con la testa; stadio 3, clono degli arti anteriori; stadio 4, allevamento con clono degli arti anteriori; stadio 5, impennamento e caduta con clono degli arti anteriori. Se il topo non viene trasferito nella gabbia a temperatura ambiente subito dopo l'induzione SE, il topo può morire a causa dell'ipertermia.
- Terminare le crisi acute comportamentali a 3 ore dall'insorgenza di SE iniettando una soluzione di diazepam (i.p.; 10 mg/kg; siringa da 1 ml; ago da 30 G). Preparare la soluzione di diazepam diluendo 5 mg/mL di diazepam in olio di ricino idrogenato al 10% di poliossile 35 aggiungendo soluzione fisiologica (i.p.; 10 mL/kg; siringa da 1 mL; ago da 30 G).
NOTA: Soluzione di olio di ricino idrogenato al 10% di poliossile 35: 1 mL di soluzione di olio di ricino idrogenato al poliossile 35 + 9 mL di soluzione fisiologica. Conservare la soluzione a temperatura ambiente. Ad esempio, se il peso corporeo del topo è di 25 g, iniettare 250 μL di soluzione di diazepam: 50 μL 5 mg/mL di diazepam + 200 μL di soluzione di olio di ricino idrogenato al 10% poliossile 35 = 250 μL 1 mg/mL di diazepam.
- Per i topi fittizi, eseguire un'iniezione i.p. della miscela di scopolamina bromuro di metile e terbutalina emisulfato (i.p.; entrambi 2 mg/kg, 10 mL/kg; siringa da 1 ml; ago da 30 G). 30 minuti dopo, iniettare la soluzione fisiologica per via intraperitoneale (i.p.; 10 ml/kg; siringa da 1 ml; ago da 30 g).
NOTA: Se il peso corporeo del topo è di 25 g, iniettare 250 μL di soluzione fisiologica invece di pilocarpina.
- Dopo l'iniezione di diazepam (i.p.; siringa da 1 ml; ago da 30 G), somministrare 1 mL di destrosio al 5% per singolo topo (i.p.; siringa da 1 mL; ago da 26 G).
NOTA: 1 ml di iniezione di destrosio al 5% fornisce una fonte di energia e idratazione che può aumentare il tasso di sopravvivenza.
- Durante la post-cura nell'incubatrice (28-30 °C), rimuovere le secrezioni eccessive come saliva, lacrime e feci.
- Al giorno 1 dopo l'induzione SE, pesare i topi e tenerli nell'incubatrice (28-30 °C) per un giorno in più. Al giorno 2, dopo l'induzione SE, pesare i topi e riportarli nella loro gabbia di casa. Fornire cibo umido per facilitare il loro recupero.
NOTA: In questo esperimento, il tasso di mortalità per C57BL/6NHsd dopo la terminazione di SE è stato in media dell'8,57% (3 su 35 topi testati).
- Misurare il peso corporeo giornaliero degli animali fino a 7 giorni dopo la pilocarpina e iniettare nei topi destrosio al 5% (i.p.; siringa da 1 ml; ago da 26 g) quando il peso corporeo non è aumentato. Interrompere il monitoraggio del peso corporeo quando i topi iniziano a riguadagnare peso corporeo e consumare cibo umido senza difficoltà a 2 giorni dopo l'iniezione di pilocarpina.
NOTA: Se il peso corporeo di un topo non è aumentato fino a 7 giorni dopo SE, escludere il topo dall'esperimento e sopprimerlo con anidride carbonica. A seconda dello sfondo del topo, occasionalmente può verificarsi la morte; tuttavia, nel caso di C57BL/6NHsd, meno dell'1% dei topi è morto in questi esperimenti. Con una sopravvivenza superiore a 7 giorni dopo l'induzione di SE, i topi raramente muoiono durante il periodo di latenza.
