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1. Sintesi e funzionalizzazione di nanoparticelle
ATTENZIONE: Tutta la sintesi dovrebbe avvenire in una cappa chimica ventilata.
- Prima della sintesi, filtrare circa 300 ml di acqua deionizzata (DI) attraverso un filtro sterile da 0,2 μm.
- Pulire un pallone di vetro a fondo tondo da 250 ml con una soluzione detergente e risciacquare con acqua deionizzata. Aggiungere 0,0134 g di CuCl2 in 100 mL di acqua deionizzata per creare una soluzione da 1 mM.
- Aggiungere 0,015 g di acido folico (FA) alla soluzione di CuCl2 e mescolare per ~5 minuti utilizzando un'ancoretta magnetica.
- Aggiungere Na2S·9H2O (0,024 g in 100 μL di acqua deionizzata) in circa 10 s alla miscela di reazione utilizzando una pipetta da 200 μL.
nota: Dopo l'aggiunta di Na2S·9H2O, la soluzione cambierà colore da un giallo chiaro a un marrone scuro.
- Chiudere la reazione e immergerla in un bagno d'olio, impostato a 90 °C, e continuare a mescolare con un'ancoretta magnetica. Dopo circa 15 minuti, o quando il bagno d'olio ha raggiunto gli 85-90 °C, lasciare che la reazione proceda per un'altra ora. La tua miscela dovrebbe gradualmente diventare di un colore verde scuro.
nota: Assicurarsi di sfiatare il sistema durante il riscaldamento della miscela di reazione per evitare l'accumulo di pressione.
- Rimuovere il recipiente di reazione dal bagno d'olio e raffreddarlo brevemente a temperatura ambiente per circa 10-15 minuti prima di trasferirlo in un bagno di ghiaccio.
- Una volta che la miscela di reazione si è raffreddata al di sotto di 20 °C, regolare il pH a 10 utilizzando 1M NaOH per sciogliere l'acido folico rimanente in soluzione.
- Purificare la miscela di reazione FA-CuS utilizzando una colonna di centrifugazione da 30 kDa. Aggiungere la soluzione in lotti da 15 mL alla colonna e centrifugare a 3,082 x g per 15 min.
- Una volta che tutta la miscela di reazione è stata concentrata, ricombinare le frazioni concentrate e lavare 4 volte con 15 mL di pH 10 NaOH nella colonna di centrifugazione da 30 kDa.
- Per le misurazioni di massa, prelevare 1/3 della soluzione (~66 μL) e dividerla in tre fiale di vetro. Asciugare in forno sottovuoto per una notte a 40 °C sotto un vuoto di ~27 mmHg.
- Sciogliere gli altri 2/3 di soluzione concentrata in 250 μl di PBS e conservare a 4 °C fino a nuovo utilizzo.
- Prima di utilizzare le NP FA-CuS, sonicarle per 30 minuti in un sonicatore da bagno ad alta velocità.
2. Assorbimento delle NP FA-CuS da parte delle cellule di cancro ovarico
- Prima dell'incubazione con NP di FA-CuS, incubare le cellule SKOV-3 in un pallone T75 con 8-15 mL di terreno RPMI-1640 privo di acido folico con il 10% di FBS e l'1% di penicillina/streptomicina per almeno 24 ore.
- Seminare le cellule in 0,5 mL di terreno di coltura completo RPMI-1640 privo di acido folico a una densità di 0,1 x 106 cellule/mL in una piastra a 24 pozzetti.
- Il giorno seguente, incubare le cellule con 400 μg/mL di NPS FA-CuS in 0,5 mL di terreno di coltura completo RPMI-1640 privo di acido folico per 2 ore.
- Dopo questa incubazione, tripsinizzare le cellule con 0,5 mL di tripsina allo 0,25% con EDTA. Aggiungere almeno 1 mL di terreno di coltura completo RPMI-1640 privo di acido folico per neutralizzare la tripsina e centrifugare le cellule a 123 x g per 6 minuti.
- Rimuovere il surnatante, risospendere le cellule in 2 mL di PBS e centrifugare a 123 x g per 6 minuti. Eseguire questa fase di lavaggio 2 volte per rimuovere eventuali NP non legate.
- Risospendere le cellule in 1-2 mL di PBS con una soluzione Tween al 2%.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro e il blu di tripano. Inoltre, diluire le cellule se la conta delle cellule è troppo alta. Diluire le cellule in PBS con il 2% di Tween alla concentrazione scelta per la rilevazione.
- Le cellule sono ora pronte per essere analizzate dal sistema PAFC.