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Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.
1. Preparazione di mitocondri da tessuti di carcinoma ovarico umano
Per questo protocollo sono stati utilizzati campioni di tessuto ovarico, inclusi tessuti di cancro ovarico (n = 7).
- Preparare 250 mL del tampone di isolamento mitocondriale mescolando 210 mM di mannitolo, 70 mM di saccarosio, 100 mM di cloruro di potassio (KCl), 50 mM di Tris-HCl, 1 mM di acido diammine tetraacetico (EDTA), 0,1 mM di glicole etilenico bis(2-amminoetiletere)acido tetraacetico (EGTA), 1 mM di inibitore della proteasi del fenilmetansulfonilfluoruro (PMSF), 2 mM di ortovanadato di sodio (V) e 0,2% di albumina sierica bovina (BSA), pH 7,4.
- Metti ~1,5 g di tessuti tumorali ovarici in un piatto di vetro pulito.
- Aggiungere 2 ml di tampone di isolamento mitocondriale pre-raffreddato per lavare leggermente il sangue dalla superficie del tessuto 3 volte.
- Utilizzare forbici oftalmiche pulite per tritare completamente il fazzoletto in circa 1 mm3 pezzi e trasferire i fazzoletti tritati in una provetta da centrifuga da 50 ml.
- Aggiungere 13,5 mL di tampone di isolamento mitocondriale contenente 0,2 mg/mL di nagarse, quindi utilizzare un omogeneizzatore elettrico per omogeneizzare (utilizzare la scala 2, 10 s 6x, intervallo 10 s) i tessuti tritati (2 min, 4 °C).
- Aggiungere altri 3 mL di tampone di isolamento mitocondriale negli omogeneizzati tissutali e mescolarli bene mediante pipettaggio.
- Centrifugare l'omogeneizzato di tessuto preparato (1.300 x g, 10 min, 4 °C). Rimuovere la frazione nucleare grezza (cioè il pellet) e conservare il surnatante.
- Ricentrifugare il surnatante (10.000 x g, 10 min, 4 °C). Rimuovere i microsomi (cioè il surnatante) e conservare il pellet.
- Aggiungere 2 mL di tampone di isolamento mitocondriale e risospendere bene il pellet mediante pipettaggio leggero.
- Centrifugare la sospensione di pellet (7.000 x g, 10 min, 4 °C). Scartare il surnatante e conservare i mitocondri grezzi (cioè il pellet).
- Aggiungere 12 mL di terreno con gradiente di densità al 25% (ad es. Nycodenz) per risospendere i mitocondri grezzi estratti.
- Realizzare un gradiente di densità discontinuo riempiendo una provetta dal basso verso l'alto con 5 mL di 34%, 8 mL di 30%, 12 mL di 25% (contenente i mitocondri grezzi del passaggio 1.11), 8 mL di 23% e 3 mL di terreno con gradiente di densità al 20% e centrifugarlo (52.000 x g, 90 min, 4 °C).
- Utilizzare una siringa lunga e smussata per raccogliere i mitocondri purificati all'interfaccia tra il mezzo di gradiente di densità del 25% e del 30% in una provetta pulita.
- Aggiungere un tampone di isolamento mitocondriale nei mitocondri raccolti per diluirlo a un volume triplo. Centrifugare (15.000 x g, 20 min, 4 °C) ed eliminare il surnatante.
- Aggiungere 2 mL di tampone di isolamento mitocondriale per risospendere il pellet e centrifugare (15.000 x g, 20 min, 4 °C). Scartare il surnatante e conservare il pellet.
- Raccogliere il pellet finale (cioè i mitocondri purificati) e conservarlo a -20 °C.
nota: Combina tutti i mitocondri purificati dal tessuto del cancro ovarico come campione di mitocondri per l'analisi di proteomica quantitativa.