Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Creazione di una linea cellulare VX2 in vitro
- Raccogliere il tumore VX2 dal muscolo quadricipite del coniglio e dalla crescita nel fianco del topo.
- Scongelare i blocchi tumorali VX2 congelati (1 cm x 1 cm), tritarli su una piastra di coltura utilizzando una lama di bisturi e filtrare attraverso un filtro da 70 μm aggiungendo piccole quantità di soluzione salina bilanciata Hanks (HBSS) in sequenza per garantire che tutte le cellule siano filtrate per un volume finale di 1 mL.
- Contare le cellule e diluirle con una soluzione salina tamponata con fosfato allo 0,9% a una concentrazione di 1 x 107/mL e metterle su ghiaccio in una provetta sterile.
nota: I blocchi tumorali sono stati ottenuti da un collaboratore di laboratorio da una precedente propagazione di tumori VX2 nei muscoli del quadricipite di coniglio.
- Anestetizzare una femmina di coniglio bianco della Nuova Zelanda (peso 2,5-3,5 kg) con isoflurano inalato al 2-5%, rimuovere il pelo sovrastante il sito di iniezione e pulire il sito di iniezione con una soluzione di iodio povidone. Iniettare 500 μl della sospensione di cellule VX2 preparata (5 x 106 cellule/mL) nel muscolo quadricipite del coniglio. Monitorare clinicamente il coniglio per la crescita del tumore a partire dal giorno 10.
- Eutanasia dei conigli dopo che i tumori hanno raggiunto un diametro di 1-1,5 cm (misurato esternamente con pinze) utilizzando un metodo approvato dal veterinario. Conferma l'eutanasia controllando i segni vitali, tra cui la frequenza cardiaca e la frequenza respiratoria. Asportare il tumore utilizzando strumenti sterili dopo aver pulito l'area con la soluzione di betadine.
- In una cabina di sicurezza biologica con strumenti sterili, tritare il tumore in piccoli pezzi (0,2 cm) su una piastra di coltura tissutale di 10 cm utilizzando una lama di bisturi. Far passare i frammenti tumorali attraverso un colino cellulare da 70 μm utilizzando 1 mL di HBSS come descritto al punto 1.1.1. Contare le cellule e diluirle con una soluzione salina allo 0,9% per ottenere 7,5 x 105 cellule in 200 μL.
- Anestetizzare i topi gamma maschi NOD SCID (peso 25 g) utilizzando isoflurano al 4% a 1 L/min e mantenere l'anestesia utilizzando isoflurano al 2%. Una volta che i topi sono stati anestetizzati, iniettare 200 μl della soluzione dal passaggio 1.1.5 nel tessuto sottocutaneo del fianco del topo utilizzando un ago calibro 27.
- Raccolta e passaggio di cellule VX2 in vitro
- Monitorare clinicamente la crescita dello xenotrapianto due volte alla settimana fino a quando i tumori raggiungono 1 cm di diametro utilizzando i calibri.
- Eutanasia dei topi mettendoli in una camera di CO2 o eseguendo la lussazione cervicale dopo l'anestetizzazione con gas isoflurano al 4%. Asportazione dei tumori in condizioni sterili in una cabina di sicurezza biologica.
- Tritare i tumori con un bisturi in pezzi di 1-2 mm in una piastra di coltura tissutale di 6 cm contenente 3 ml di terreno di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/Ham'ss F12+ 10% di siero fetale bovino (FBS).
- Lasciare indisturbati i frammenti tumorali in un'incubatrice a 37 °C con il 5% di CO2 per due giorni fino a quando le cellule iniziano a crescere dai pezzi tumorali. Successivamente, controllare quotidianamente le piastre coltivate mediante microscopia ottica per verificare la presenza di confluenze cellulari. Al raggiungimento della confluenza del 70%, tripsinizzare le cellule aggiungendo 1 mL di tripsina allo 0,05% al pallone e rimettendole nell'incubatore a 37 °C per 5 minuti.
- Neutralizzare la tripsina con 6 mL di DMEM/Ham'ss F12 + 10% di terreno FBS, raccogliere le cellule e centrifugare a 4 °C per 5 minuti a 300 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 3,5 mL di nuovo DMEM/Ham'ss F12 + 10% di terreno FBS. Semina piastre rivestite di collagene I fresche da 6 cm con 1,6 x 106 cellule per piastra per ottenere una densità di semina cellulare di circa il 50><%.
NOTA: La densità cellulare del 50% si riferisce alle celle che occupano il 50% della superficie della piastra quando sono attaccate.
- Passaggio precoce: ripetere il processo di cui sopra (tripsinizzazione, semina) fino a quando le cellule non sono state passate 5 volte e quindi valutare la purezza della linea cellulare con PCR utilizzando un test PCR quantitativo per distinguere il DNA genomico del coniglio dal DNA genomico del topo (vedere i passaggi 1.3.1-1.3.4><).
nota: Dopo 8 passaggi, le cellule possono essere propagate su piastre di coltura tissutale aderenti regolari non rivestite di collagene.
- Passaggio, tripsinizzazione e congelamento di aliquote di cellule in DMEM/HAM F12+30% FBS+10%DMSO ad una concentrazione di 2 x 106 per flaconcino. Conservare le cellule in azoto liquido fino a quando non sono necessarie per gli esperimenti.
- Conferma dell'origine VX2 delle cellule sopravvissute:
- Creare una cura standard dal DNA genomico purificato di topo e coniglio (Passaggio 1.3.2 e Passaggio 1.3.3). Utilizzare primer che mirano a sequenze specie-specifiche all'interno del secondo frame di lettura aperto dell'elemento retrotrasposone LINE-1.
nota: Le sequenze di primer per CRPV E6 sono: 5's- GATCCTGGACCCAACCAGTG e 5's-CCTGCCGGTCCCTGATTTAT. Sono stati utilizzati gli elementi retrotrasposoni LINE-1. Le sequenze di primer per il coniglio LINE-1 sono: 5's-TCAGGAAACCCCAGAAAGTATGC e 5's-TTTGATTTCTTGAATGACCCAGTGT Le sequenze di primer per il topo LINE-1 sono: 5's-AATGGAAAGCCAACATTCACGTG e 5's-CCTTCCTTGACCAAGGTATCATTG
- Per creare una curva standard per CRPV E6, purificare il lisato di cellule tumorali VX2 (Passaggio 1.1.1) utilizzando un kit commerciale che segue il protocollo del produttore. Quantificare questo DNA utilizzando un saggio commerciale. Eseguire 6 diluizioni seriali da 225 pg/μL a 0,925 pg/μL in tampone EDTA-TE basso. Per creare una curva standard per il DNA genomico di topo, diluire 100 μg di DNA genomico di topo commerciale in un tampone EDTA-TE basso in 5 diluizioni da 125 pg/μL fino a 0,0125 pg/μL.
- Posizionare 4 μl da ciascuna soluzione diluita dai campioni della fase 1.3.2 nei pozzetti ed eseguire i campioni in un termociclatore PCR. Utilizzare i valori Cq di ogni corsa insieme alle quantità di DNA per pozzetto per calcolare una curva standard utilizzando le impostazioni di soglia automatica del software del termociclatore.
- Utilizzare le procedure qPCR standard per eseguire la PCR con 40 cicli di cicli in 2 fasi (98 °C e 60 °C) su un termociclatore. Stabilire i valori soglia e impostare i valori delta Ct a >35 per garantire che la contaminazione del topo nella linea cellulare VX2 del coniglio sia minima. Il volume totale di ciascuna reazione era di 10 μL, costituito da 5 μL di 2x Mastermix, 1 μL di primer forward + reverse con concentrazione finale del primer in reazione a 250 nM e 4 μL di campione di DNA.
nota: I valori soglia sono stabiliti e i valori delta Ct sono fissati a >35 per garantire che vi sia una contaminazione minima del topo nella linea cellulare VX2 del coniglio. Il livello raccomandato di DNA VX2 per una rilevazione affidabile mediante qPCR è 1-10 pg.
2. Coltura cellulare VX2 e creazione di sospensione cellulare
- Scongelare i flaconcini contenenti cellule VX2 (congelate al punto 1.2.7) in un bagno d'acqua a 37 °C per 1 minuto e trasferire le cellule in una provetta da centrifuga conica con 10 mL di terreno di coltura (1:1 DMEM/F-12 + 10% FBS e 1% Penicillina-streptomicina). Centrifugare per 8 minuti a 107 x g, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 9 mL di terreno.
- Trasferire le cellule sospese in un grande pallone di coltura. Incubare le cellule senza agitarle a 37 °C. Controllare quotidianamente la confluenza delle cellule utilizzando la microscopia ottica e cambiare i terreni di coltura ogni tre giorni.
- Creazione di una sospensione iniettabile di cellule VX2 in coltura
- Tripsinizzare le cellule aggiungendo 3 mL di tripsina allo 0,25% al pallone una volta che le cellule hanno raggiunto l'80% di confluenza. Mettere il pallone nell'incubatore (37 °C) per 5 minuti. Trasferire la soluzione in una provetta da centrifuga conica e centrifugare per 8 minuti a 107 x g, quindi rimuovere il surnatante.
- Lavare i pellet cellulari 3 volte con 9 mL di soluzione salina tamponata con fosfato, centrifugare e rimuovere il surnatante come sopra. Contare le cellule e diluirle con una soluzione salina tamponata con fosfato allo 0,9% a una concentrazione di 4 x 107 cellule/mL e metterle in una provetta da centrifuga conica sterile su ghiaccio.
- Creazione di una sospensione iniettabile di cellule VX2 propagate in vivo
- Scongelare i blocchi tumorali VX2 congelati (1 cm x 1 cm), tritarli su una piastra di coltura utilizzando una lama di bisturi e filtrare attraverso un filtro da 70 μm come al punto 1.1.1. Aggiungere piccole quantità di HBSS in sequenza per garantire che tutte le cellule siano tese per un volume finale di 1 mL. Contare le cellule e diluirle con soluzione salina tamponata con fosfato allo 0,9% a una concentrazione di 1 x107/mL e metterle su ghiaccio in una provetta sterile.
nota: I blocchi tumorali sono stati ottenuti da un collaboratore di laboratorio da una precedente propagazione di tumori VX2 nei muscoli del quadricipite di coniglio.
3. Istituzione del modello chirurgico
- Istituzione dell'anestesia chirurgica e preparazione preoperatoria
- Pre-medicare le femmine di coniglio bianco della Nuova Zelanda (2,5-3,5 kg) 1 ora prima della procedura chirurgica pianificata utilizzando iniezioni di acepromazina (1 mg/kg IM) e meloxicam (0,2 mg/kg SQ). Anestetizzare una femmina di coniglio bianco della Nuova Zelanda (peso 2,5-3,5 kg) con isoflurano inalato al 2-5%, rimuovere il pelo sovrastante il sito di iniezione e pulire il sito di iniezione con una soluzione di iodio povidone.
- Intubare i conigli anestetizzati utilizzando una maschera laringea per le vie aeree (LMA) e fissarli in posizione con nastro adesivo, mantenendo l'anestesia profonda titolando la dose di isoflurano per via inalatoria tra il 2 e il 5%. Monitorare regolarmente l'anestesia chirurgica durante tutta la procedura controllando i segni vitali (frequenza respiratoria, riempimento capillare, saturazione di ossigeno se disponibile) e monitorando i segni suggestivi di dolore (movimento, ritiro dagli stimoli, rumori) o leggera anestesia (movimento, masticazione del tubo LMA).
nota: Questo dovrebbe essere fatto da qualcuno con esperienza nel monitoraggio dell'anestesia chirurgica.
- Posizionare un catetere orecchio-vena calibro 22 nella vena dorsale marginale. Somministrare cefazolina (20 mg/kg) per via endovenosa 10 minuti prima dell'incisione cutanea chirurgica.
- Agganciare i peli sul bacino e sull'addome prima di posizionare il coniglio sul tavolo operatorio, quindi posizionare i conigli in posizione dorsale sul tavolo operatorio. Pulire il campo chirurgico utilizzando una preparazione chirurgica della pelle in 3 fasi (sapone betadine, soluzione di clorexidina, soluzione di betadine). Avvolgere il campo chirurgico con teli per laparotomia dopo aver marcato la parte superiore dell'osso pubico, lasciando esposta un'area di 5 cm x 5 cm del basso ventre.
- Creazione dell'incisione laparotomica e identificazione delle corna uterine
- Indossa un berretto chirurgico e una maschera facciale. Strofinare le mani con la clorexidina o la soluzione chirurgica di betadine. Utilizzando la tecnica sterile, indossare un camice sterile e guanti chirurgici sterili.
- Utilizzando un bisturi a 11 lame #, praticare un'incisione lunga 2,5 cm 1 cm craniale alla sinfisi pubica attraverso la pelle e il tessuto sottocutaneo dell'addome del coniglio. Incidere la fascia del retto e sezionare lateralmente i muscoli retti per esporre il peritoneo sottostante. Entrare bruscamente nel peritoneo dopo essersi assicurati che la superficie inferiore sia libera da intestino o altri organi addominali.
- Localizzare le corna uterine identificando la vescica urinaria e passando un dito guantato superiormente, posteriormente e lateralmente sopra l'apice della vescica><.
nota: Se necessario, l'intera vescica può essere svuotata utilizzando la pressione digitale. Una volta localizzate, portare le corna uterine attraverso l'incisione addominale per appoggiarle sulla parete addominale.
- Utilizzando una sutura riassorbibile intrecciata 3-0, eseguire una singola legatura di sutura di ciascun corno uterino a circa 1,5-2,0 cm distale rispetto alla cervice. Posizionare la sutura appena medialmente alle arterie uterine, che corrono lungo la faccia laterale di ciascun corno. Legare saldamente le suture per occludere le corna uterine distali (Figura 1).
- Inoculazione miometriale VX2
- Utilizzando un ago calibro 27, iniettare 0,5 mL della sospensione di cellule VX2 precedentemente preparata dallo step 2.3.2 (per il modello VX2 in coltura) o 2.4 (per il modello VX2 propagato in vivo) nel miometrio di ciascun corno uterino prossimale al sito di sutura (tra il sito di sutura e la cervice). Iniettare per oltre 1 minuto e assicurarsi che le cellule non vengano iniettate nella cavità uterina sottostante. Anestetizzare gli animali utilizzando isoflurano inalato (2-5%) e una macchina anestetica con un circuito Bain.
- Applicare pressione sul sito di iniezione miometriale per 30 s dopo l'iniezione per ridurre al minimo la perdita di cellule. Ispezionare i siti di iniezione e sutura per l'emostasi e riposizionare le corna uterine nell'addome.
- Chiusura dell'incisione chirurgica
- Chiusura profonda della parete addominale: identificare l'apice dell'incisione peritoneale e afferrare il peritoneo, il muscolo retto e la fascia con una pinza per tessuti.
- Per fare ciò, ancorare la sutura a un apice dell'incisione suturando da superficiale a profonda su un lato dell'incisione e da profonda a superficiale sull'altro. Fai un nodo. Utilizzando la sutura attaccata, praticare punti di sutura perpendicolari all'incisione attraverso gli strati della parete addominale lavorando gradualmente lungo l'incisione da un lato all'altro. Legare la sutura e tagliare.
- Chiusura superficiale della parete addominale: identificare l'apice dell'incisione cutanea e suturare la pelle addominale utilizzando una sutura in polifilamento riassorbibile 3-0 sottocuticolare sepolto. Applicare la colla chirurgica sull'incisione chiusa per opporsi ai bordi della pelle.
- Per fare ciò, ancorare la sutura a un apice dell'incisione, suturando da profondo a superficiale da un lato dell'incisione e da superficiale a profondo dall'altro. Fai un nodo. Utilizzando le suture attaccate, praticare punti di sutura nello strato dermico paralleli all'incisione lavorando gradualmente lungo l'incisione da un lato all'altro. Legare la sutura e tagliare.
- Assistenza post-operatoria
- Risveglio dall'anestesia: spegnere l'isoflurano una volta chiusa l'incisione e lasciare che il coniglio respiri ossigeno con la maschera mentre monitora i segni del risveglio (ad esempio, movimenti spontanei, apertura degli occhi e movimenti di masticazione sulle vie aeree della maschera laringea). Estubare il coniglio una volta notati questi segni e fornire ossigeno con una maschera e una coperta calda fino a quando i conigli non sono vigili e in grado di sedersi in modo indipendente.
- Monitoraggio post-operatorio: monitorare i conigli due volte al giorno per 4 giorni e ogni giorno per altri 10 giorni dopo l'intervento. Per monitorare, valutare le loro condizioni generali, l'assunzione di cibo e acqua, la produzione di urina e feci, la valutazione del dolore, il peso, i segni vitali (frequenza cardiaca, frequenza respiratoria) e il loro sito chirurgico alla ricerca di gonfiore, eritema, secrezione o deiscenza.
- Controllo del dolore post-operatorio: somministrare Meloxicam ogni giorno (0,2 mg/kg mq) per 48 ore dopo l'intervento e poi secondo necessità in base alla valutazione del dolore. Somministrare buprenorfina immediatamente dopo l'intervento e ogni 12 ore (0,01-0,05 mg/kg mq) per 24 ore e poi secondo necessità in base alla valutazione del dolore
- Gli antibiotici (enrofloxacina 5 mg/kg IM) possono essere somministrati quotidianamente per sette giorni dopo l'intervento per prevenire l'infezione della ferita come raccomandato dal veterinario. Somministrare liquidi sottocutanei (15 ml di SQ) due volte al giorno secondo necessità per la disidratazione e cibi morbidi o altri integratori alimentari vengono forniti quotidianamente secondo necessità per la perdita di peso.
