Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di JoVE.
1. Impostazione e incubazione del vetrino trattato con ITO per le cocolture
- Cocolture indivise
- Fluidificare l'agarosio a 70 °C su una piastra calda.
- Posizionare il divisore a 8 pozzetti sopra il vetrino trattato con ossido di tinuro di indio (ITO) (Figura 1A). Il fondo in gomma sul divisore favorisce l'adesione al vetrino, ma assicurati di applicare una leggera pressione continua verso il basso durante la placcatura in agarosio per garantire che non ci siano perdite o mescolamenti tra i pozzetti.
- Raccogliere le cellule in una provetta conica da 15 mL, centrifugarle (5 min a 800 giri/min) e risospenderle a 50k cellule per 150 μL in 1x terreno DMEM. Se una densità cellulare diversa è ottimale, assicurarsi che in questa fase la sospensione cellulare sia 2 volte la densità finale desiderata (ad esempio, per una concentrazione finale di 50.000 cellule in 300 μl, la densità cellulare in questa fase è di 50.000 celle in 150 μl).
- Prima di piastrare la coltura cellulare, aggiungere l'espianto ovarico al centro del pozzetto (Figura 1B).
- Aggiungere l'agarosio a ciascuna coltura cellulare in singole provette da 2 mL appena prima della piastra. Per ogni pozzetto, combinare 200 μl di sospensione cellulare e 200 μl di agarosio liquefatto in una provetta da 2 mL. Ad esempio, per quattro pozzetti, combinare 800 μl di sospensione cellulare e 800 μl di agarosio al 2%. Avanzerà un po' di miscela, ma prepararne un po' più del necessario evita la formazione di bolle d'aria durante il pipettaggio.
- Aggiungere l'agarosio alle singole colture cellulari immediatamente prima di piastrarle. L'agarosio si raffredderà in meno di un minuto, quindi preparati a impiattare rapidamente.
- Aggiungere immediatamente 300 μl della miscela cellula/agarosio a ciascun pozzetto (Figura 1C). La Figura 1C mostra tre condizioni cellulari e una condizione del terreno, ciascuna placcata con e senza ovaio.
- Incubare il vetrino a 37 °C e 5% di CO₂ in un incubatore umidificato.
- Cocolture divise
- Tagliare i divisori da plastica sottile e liscia (Figura 2A).
nota: Questo esperimento utilizza i lati di una bacinella sterile monouso perché sono piatti e sottili. Tagliateli abbastanza larghi da inserirli perfettamente nell'ipotenusa del pozzetto (~13 mm).
- Fluidificare l'agarosio a 70 °C su una piastra calda.
- Posizionare il divisore a 8 pozzetti sopra il vetrino trattato con ITO (Figura 2B). Il fondo in gomma sul divisore favorisce l'adesione al vetrino, ma assicurati di applicare una leggera pressione continua verso il basso durante la placcatura in agarosio per garantire che non ci siano perdite o mescolamenti tra i pozzetti.
2. Scivolo di asciugatura e preparazione per MALDI-TOF MS
- Dopo quattro giorni (o qualsiasi punto temporale preferito), rimuovere il divisore della camera dai tappi di agarosio e dal vetrino (Figura 1D). Staccare delicatamente i lati dell'agarosio dalla camera con una spatola piatta e tirare delicatamente la camera verso l'alto, facendo attenzione a non spostare i tappi di agarosio. Se si muovono, riposizionali delicatamente in modo che non si tocchino.
- Mettere il vetrino in forno a 37 °C per circa 4 ore, ruotandolo di 90° ogni ora.
nota: La rotazione del vetrino è importante per garantire una distribuzione uniforme del calore in tutto il campione.
- Una volta asciutto, rimuovere il vetrino dal forno (Figura 1E).
- Applicare la soluzione a matrice utilizzando lo spruzzatore (Figura 1F), con i seguenti parametri: temperatura = 30 °C, portata = 0,2 mL/min, numero di passaggi = 8, direzione = CC e distanza dell'ugello = 40 mm.
nota: Al posto di uno spruzzatore a matrice, è possibile utilizzare un aerografo artistico per applicare la matrice liquida. La stessa soluzione di matrice può essere utilizzata per spruzzare, ma è necessaria circa il doppio della soluzione. Con il vetrino bloccato in modo che penda verticalmente, spruzzare il vetrino da un angolo di 90° a circa un piede di distanza fino a quando lo strato della matrice non è visibile.
- Aggiungere 1 μL di calibrante (rosso fosforo per target <500 Da), una miscela di peptidi (vedere la Tabella dei materiali) per target <5.000 Da) per eliminare i punti sul vetrino. Il rosso fosforo non richiede miscelazione con la matrice, ma la miscela peptidica richiede una miscela 1:1 con la matrice per favorire la ionizzazione. Attendere che il calibrante si asciughi.
- Disegna una X usando un pennarello indelebile su ogni angolo della diapositiva e scatta un'immagine ottica usando una fotocamera o uno scanner a 1.200 dpi.
