Imaging basato su nanosonda SERRS funzionalizzato con anticorpi: una tecnica di imaging Raman altamente sensibile per rilevare il carcinoma ovarico metastatico in vivo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Sintesi del nucleo di nanostar d'oro

NOTA: Le nanostelle d'oro vengono utilizzate come nuclei per entrambe le versioni di nanosonde SERRS utilizzate in questo esperimento.

1. Preparare 800 mL di soluzione di acido ascorbico 60 mM (C₆H₈O₆) in acqua deionizzata (DI) e 8 mL di soluzione di acido tetracloroaurico 20 mM (HAuCl₄) in acqua deionizzata. Raffreddare a 4 °C.
2. Eseguire questa fase di reazione a 4 °C. Porre un matraccio conico contenente 800 mL di soluzione di acido ascorbico su una piastra di agitazione magnetica e indurre un vortice costante. Aggiungere rapidamente 8 mL della soluzione di acido tetracloroaurico nel vortice. In pochi secondi, si formeranno nanostelle e la soluzione assumerà un colore blu scuro. Se il colore in qualsiasi momento diventa rosa o viola, a significare la formazione di nanosfere, la sospensione deve essere scartata e la sintesi ritentata.
3. Versare la sospensione nanostar in provette coniche da 50 mL e centrifugare per 20 minuti (4 °C, 3.220 x g). Aspirare il surnatante lasciando circa 200 μl di soluzione in ciascuna provetta. Prestare attenzione a non disturbare il pellet di nanoparticelle sul fondo del tubo.
   nota: Il surnatante dovrebbe avere una tinta blu a causa delle nanostelle sospese rimanenti.
4. Utilizzando una micropipetta, agitare la soluzione per sospendere e raccogliere le nanoparticelle da ciascun tubo. Una parte del pellet può essere compattata sul fondo della provetta e non si riaccende nemmeno con un pipettaggio vigoroso: scartare questa parte.
5. Trasferire la sospensione di nanoparticelle in una cassetta per dialisi (MWCO 3,5 kDa) e dializzare almeno tre giorni contro 2 L di acqua deionizzata, cambiando l'acqua ogni giorno. Conservare le nanostelle in dialisi a 4 °C per un massimo di un mese con cambi d'acqua ogni 3-4 giorni.
   nota: Le nanostelle devono essere conservate in dialisi fino a quando non sono necessarie per la reazione di siliceazione, come descritto nella sezione 2.

2. Formazione del guscio di silice

NOTA: Sono sintetizzate due versioni di nanosonde Raman. La procedura di sintesi è la stessa per entrambi, con l'unica differenza che viene utilizzata la molecola reporter Raman (colorante). In questo esperimento vengono utilizzati il perclorato IR780 e l'IR140. La reazione deve essere sempre eseguita in contenitori di plastica. La sintesi è altamente scalabile e può essere regolata per la quantità desiderata di iniettato richiesta. Qui viene descritta una sintesi in lotti medi, che può essere scalata linearmente a volumi inferiori o superiori a seconda delle necessità, con le stesse concentrazioni e tempi di reazione. Le reazioni per i due tipi di nanosonda SERRS possono essere eseguite in parallelo. Prestare attenzione per evitare la contaminazione incrociata. La sonicazione deve essere eseguita per la ridispersione dei pellet di nanoparticelle dopo la centrifugazione durante le fasi di lavaggio o dopo che le nanoparticelle sono state conservate per più di un'ora. La sonicazione deve essere eseguita fino a quando le nanoparticelle non sono chiaramente sospese nella soluzione, in genere per 1 s.

1. Nella provetta A (una provetta conica da 50 mL), miscelare 10 mL di isopropanolo, 500 μL di TEOS, 200 μL di acqua deionizzata e 60 μL di colorante (IR780 perclorato o IR140, 20 mM in DMF (dimetilformammide)).
2. Nella provetta B (una provetta conica da 15 mL), mescolare 3 mL di etanolo e 200 μL di idrossido di ammonio. Sonicare le nanostelle dal passaggio 1.4 per disperdere eventuali ammassi in soluzione e aggiungere 1,2 mL di nanostelle al tubo.
   NOTA: la soluzione di idrossido di ammonio è altamente volatile e difficile da pipettare con precisione. Conservarlo a 4 °C, fino al momento del bisogno, per facilitare il pipettaggio.
3. Posizionare il tubo A su un miscelatore a vortice e indurre un vortice costante. Aggiungere rapidamente il contenuto della provetta B nel vortice e continuare a mescolare per circa 5 s. Trasferire immediatamente in uno shaker e lasciarlo agire per 15 minuti agitando a 300 giri/min, a temperatura ambiente.
4. Dopo l'incubazione di 15 minuti, spegnere la reazione aggiungendo etanolo per riempire la provetta da 50 mL. Centrifugare per 20 minuti a 3.220 x g e 4 °C.
5. Aspirare il surnatante, lasciando circa 0,5 mL di soluzione, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Aggiungere 1 mL di etanolo e agitare con una pipetta per risospendere le nanoparticelle. Trasferire in una provetta da centrifuga da 1,5 ml e lavare 4 volte con etanolo centrifugando a 11.000 x g per 4 minuti, aspirando il surnatante e risospendendo il pellet mediante ultrasuoni per circa 1 s.
6. NOTA: In questa fase, le nanoparticelle silicate possono essere funzionalizzate, come descritto nella sezione 3, o risospese in acqua deionizzata con una fase di lavaggio aggiuntiva, per essere conservate a 4 °C per un massimo di una settimana.

3. Funzionalizzazione della superficie

NOTA: Le nanosonde IR780 SERRS saranno coniugate con anticorpi mirati al recettore dei folati tramite un reticolante PEG per formare αFR-NP; Le nanosonde di controllo IR140 SERRS saranno coniugate con un monostrato PEG passivante, per nt-NPs. Entrambi i sapori si formano tramite una reazione tiolo-maleimmide in reazioni separate ma parallele.

1. Lavare le nanoparticelle due volte centrifugando a 11.000 x g per 4 minuti, aspirando il surnatante e risospendendo il pellet in 1 mL di etanolo mediante ultrasuoni. Ripetere ancora una volta la fase di lavaggio, ma disperdere nuovamente in 1 mL di etanolo all'85%, 3-MPTMS al 10% (3-mercaptopropiltrimetossisilano) e acqua deionizzata al 5%. Incubare a temperatura ambiente per 1-2 ore per introdurre i tioli sulla superficie delle particelle.
2. Lavare le nanoparticelle funzionalizzate con tiolo centrifugando a 11.000 x g per 4 minuti, aspirando il surnatante e risospendendo il pellet mediante ultrasuoni, due volte in etanolo, due volte in DI e infine in tampone HEPES (acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico) (10 mM, pH 7,1) e mettere da parte.
3. NOTA: Deve essere utilizzato il tampone MES (acido 2-(N-morfolino) etansolfonico) o HEPES. I tamponi con salinità più elevata, come la PBS (soluzione salina tamponata con fosfato), possono indurre l'aggregazione di nanoparticelle.
4. Per gli anticorpi αFR-NP funzionalizzati, reagire 200 μg di anticorpi (clone di anticorpi anti-proteina legante il folato [LK26]) con un eccesso molare di dieci volte di reticolante PEG (poli(glicole etilenico)(N-idrossisuccinimide 5-pentanoato) etere N'-(3-maleimidopropionil) amminoetano (CAS: 851040-94-3), in dimetilsolfossido (DMSO)) in 500 μL di tampone MES (10 mM, pH 7,1) per 30 minuti.
5. Rimuovere il reticolante in eccesso e concentrare l'anticorpo centrifugando la soluzione anticorpo-PEG in un filtro centrifugo (MWCO 100 kDa). Per i filtri centrifughi utilizzati in questo studio, eseguire la centrifugazione per 10 minuti a 14.000 x g e 23 °C. Recuperare gli anticorpi coniugati in una provetta nuova capovolgendo il filtro e centrifugando a 1.000 x g per 2 minuti.
6. Pipettare le nanoparticelle IR780 del passaggio 3.2 nella provetta con gli anticorpi e agitare con la pipetta per miscelare. Incubare la miscela per almeno 30 minuti a temperatura ambiente o a 4 °C durante la notte per formare gli αFR-NP.
7. Per formare nt-NPs, aggiungere l'1% p/v di metossi-terminato (m)PEG5000-maleimmide (CAS: 99126-64-4) disciolto in DMSO alle nanoparticelle IR140 SERRS del passaggio 3.2 e lasciare reagire in 500 μL di tampone MES (10 mM, pH 7,1) per almeno 30 minuti a temperatura ambiente o a 4 °C durante la notte.
8. Per la somministrazione ai topi (sezione 4), ridurre entrambi i gusti di nanosonda a 11.000 x g per 4 minuti, aspirare il surnatante per rimuovere la soluzione con anticorpi/PEG liberi non reagiti e ridisperdere ciascun sapore nel tampone MES (10 mM, pH 7,1) a concentrazioni di 600 pM. Quando si risolubilizzano le nanoparticelle, ridurre al minimo l'esposizione non necessaria agli ultrasuoni per prevenire la denaturazione dell'anticorpo.

4. Iniezione e imaging di nanosonde

1. Preparare le nanosonde (αFR-NP e nt-NP) come descritto nelle sezioni 1-3 e miscelare in un rapporto 1:1, per una concentrazione finale di 300 pM di ciascun tipo in tampone MES (10 mM, pH 7,1). Facoltativamente, preparare standard di riferimento di 30 pM di ciascuno dei gusti della nanosonda in piccole provette coniche (100 μL).
2. Iniettare per via intraperitoneale 1 mL della sospensione di nanoparticelle in ciascun topo e massaggiare delicatamente la pancia per distribuire le nanoparticelle all'interno della cavità peritoneale. Rimetti il mouse nel suo alloggiamento. Dopo 25 o più minuti, sopprimere il topo tramite asfissia da CO₂.
3. Fissare il mouse su una piattaforma chirurgica, in posizione supina (per l'imaging dell'intero addome, la piattaforma deve essere montabile sul tavolino verticale del microscopio).
   1. Utilizzando una pinza seghettata e le forbici da dissezione, rimuovere la pelle per esporre il peritoneo ed eseguire una grande incisione sagittale (tra i 2 e i 3 cm di lunghezza) per esporre l'intero addome. Fissare le alette peritoneali sulla piattaforma. Lavare l'interno della cavità peritoneale con almeno 60 ml di PBS utilizzando un flacone di plastica.
      NOTA: Per consentire l'imaging senza ostacoli dell'intero addome, l'intestino deve essere mobilizzato o asportato. Per l'escissione, resecare con una legatura dei vasi mesenterici al fine di ridurre l'emorragia nella cavità addominale.
   2. In alternativa, per visualizzare organi specifici, asportarli dopo il lavaggio PBS e posizionarli su un vetrino da microscopio.
4. Trasferire la piattaforma o il vetrino su un microspettrofotometro Raman con configurazione ottica verticale e un tavolino motorizzato per l'imaging; utilizzare un sistema commerciale con un laser a diodi da 300 mW 785 nm, con un reticolo di 1.200 scanalature per mm, centrato a 1.115 ^cm-1.
   1. Focalizzazione dell'area di interesse utilizzando ottiche a luce bianca, parafocali con il laser Raman. Selezionare l'area da fotografare e la risoluzione desiderata; In questo rapporto è stata utilizzata una modalità di acquisizione ad alta velocità (spettri acquisiti in continua illuminazione laser con il tavolino del microscopio in costante movimento, con risoluzione spaziale effettiva di 14,2 μm per 200 μm; a 5x di ingrandimento, 100 mW di potenza all'obiettivo e <100 ms di esposizione per punto).
      nota: Le provette con le nanosonde di riferimento del passaggio 4.1 possono essere posizionate all'interno dell'area di stampa, se lo si desidera, per fornire standard di riferimento interni per l'analisi successiva. Assicurarsi che nessuna fonte di luce estranea diversa dal laser raggiunga l'obiettivo.
5. Facoltativamente, preparare il campione per l'elaborazione istologica e la convalida mediante fissazione in paraformaldeide al 4% in PBS per una notte a 4 °C. Sciacquare con PBS a 4 °C per 15 minuti almeno due volte. Conservare il campione in etanolo al 70% in acqua fino al trattamento istologico standard e all'inclusione in paraffina. Per la convalida istologica dei tumori, le sezioni (5 μm di spessore) provenienti da diverse profondità del blocco di paraffina possono essere colorate con ematossilina ed eosina (H&E).