Sistema di coltura prossimale: una tecnica di coltura in vitro per studiare la segnalazione paracrina tra le cellule

Abstract

Fonte: Dasari, S. et al. Un metodo di coltura prossimale per studiare la segnalazione paracrina tra le cellule.J. Vis. Exp. (2018)

In questo video, sviluppiamo un modello di co-coltura prossimale di cellule tumorali ovariche e cellule mesoteliali umane primarie. Questo modello fisiologicamente rilevante consente lo studio della segnalazione paracrina, in cui le concentrazioni localizzate dei fattori secreti vengono mantenute impedendo il contatto cellulare diretto.

Protocollo

A. Preparazione delle cellule

1. Isolamento e coltura di cellule mesoteliali primarie umane
   1. Isolare le cellule mesoteliali primarie umane (HPMC) dall'omento umano e farle crescere in un terreno di crescita completo [Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) contenente il 10% di siero fetale bovino, l'1% di penicillina-streptomicina, l'1% di aminoacidi non essenziali e l'1% di vitamine] a 37 °C e il 5% di CO₂,
      nota: Le HPMC sono in genere coltivate al 100% di confluenza (Figura 1A).
2. Condizioni di crescita delle cellule tumorali ovariche
   1. Coltivare cellule di cancro ovarico HeyA8 in un terreno di crescita completo a 37 °C e 5% di CO₂,
      nota: Utilizzare cellule HeyA8 cresciute a circa l'80% di confluenza (Figura 1B).

B. Coltura cellulare

1. Configurazione della coltura prossimale
   1. Utilizzare gli inserti Transwell per piastre a 6 pozzetti con membrana in policarbonato trattata con coltura tissutale di 10 μm di spessore con pori di 0,4 μm (10,⁸ pori/cm²) e un'area di crescita di 4,67^cm2. Se necessario, ottimizzare le diverse dimensioni dell'inserto scalando il numero di cellule seminate in base all'area della superficie di crescita. Riscaldare il terreno di coltura completo, la tripsina e la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a 37 °C prima dell'uso.
2. Preparazione degli inserti
   1. Per seminare le cellule HeyA8 sulla superficie inferiore della membrana dell'inserto, rimuovere l'inserto dalla sua confezione utilizzando una pinza sterile e posizionarlo capovolto in una piastra di coltura sterile da 15 cm.
   2. Utilizzare un piatto da 15 cm, in quanto ha la profondità necessaria per accogliere l'inserto rovesciato, oppure sostituirlo con un contenitore sterile appropriato. A seconda dell'esperimento, posizionare il numero richiesto di inserti nel piatto da 15 cm.
   3. Etichettare i tre controlli e le tre condizioni sperimentali di conseguenza con un pennarello sul bordo degli inserti.
3. Preparazione delle cellule tumorali
   1. Per tripsinizzare le cellule HeyA8 cresciute all'80% di confluenza in un pallone da 25 cm² (~2 x 10⁶ cellule), aggiungere 1 mL di tripsina (0,25%) per 40-60 s e neutralizzare la tripsina con 6 mL di terreno di crescita completo.
   2. Centrifugare le cellule a 500 x g a temperatura ambiente (RT) per 3 minuti, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 5 mL di terreno di crescita completo. Contare le cellule vive utilizzando il metodo di esclusione del colorante blu di tripano.
4. Semina delle cellule tumorali
   1. Sospendere 100.000 cellule/mL di cellule HeyA8 vive in un terreno di crescita completo. Seminare con cura 80.000 cellule HeyA8 sospese in 800 μL di terreno di crescita completo sul fondo dell'inserto (che ora è rivolto verso l'alto, poiché è capovolto).
   2. Seminare le cellule in modo da formare una forma a cupola in modo che le cellule rimangano sull'inserto (Figura 1C). Iniziare dal centro della membrana e spostarsi verso l'esterno in cerchi concentrici mentre si pipetta lentamente. Evitare di allontanarsi a più di 3 mm dal bordo per evitare fuoriuscite del fluido.
      nota: Il numero di cellule seminate dipenderà dal tasso di crescita delle cellule e dalla durata dell'esperimento. Il numero di cellule HeyA8 seminate per questa coltura prossimale è stato ottimizzato e le cellule saranno confluenti all'80-90% alla fine del terzo giorno.
5. Attaccamento alle cellule tumorali
   1. Coprire la piastra da 15 cm e spostare con cautela la piastra contenente gli inserti nell'incubatrice di CO₂. È fondamentale non interrompere la caduta del terreno e delle cellule sull'inserto in questa fase. Lasciare le cellule a 37 °C per 4 ore per consentire alle cellule tumorali di attaccarsi all'inserto.
6. Preparazione delle cellule mesoteliali
   1. Dopo circa 4 ore, tripsinizzare le HPMC cresciute al 100% di confluenza in un pallone da 75 cm² (~4 x 10⁶ cellule) con 2 mL di tripsina (0,25%) per 1-2 minuti e neutralizzare la tripsina con 12 mL di terreno di crescita completo.
   2. Centrifugare le cellule a 500 x g a RT per 3 minuti, risospendere il pellet cellulare in 10 mL di terreno di crescita completo e contare le cellule vive utilizzando il metodo di esclusione del colorante blu di tripano.
7. Semina delle cellule mesoteliali
   1. Sospendere 300.000 cellule/mL di HPMC vivi in un terreno di crescita completo. Aggiungere 2,5 mL di terreno di coltura completo fresco a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Portare con cautela la capsula da 15 cm contenente gli inserti nella cappa di biosicurezza. Utilizzando una pinza sterile, capovolgere l'inserto e posizionarlo nel pozzetto della piastra a 6 pozzetti in modo che sia in posizione verticale, con le cellule HeyA8 attaccate alla superficie inferiore immerse nel mezzo di crescita completo (Figura 1C).
   2. Seminare 450.000 HPMC sospesi in 1,5 mL di terreno di crescita all'interno degli inserti con le cellule HeyA8 attaccate alla superficie rivolta verso il fondo del pozzetto (Figura 1C) o agli inserti senza cellule HeyA8 per i controlli HPMC. Aggiungere 1,5 ml di terreno di coltura senza cellule ai controlli HeyA8.
8. Crescita della cultura prossimale
   1. Lasciare crescere la coltura prossimale nell'incubatore di CO₂ a 37 °C e CO₂ al 5% per 72 ore. Se necessario, il fluido può essere rabboccato come segue.
      1. Per l'interno dell'inserto, rimuovere 750 μl e aggiungere 750 μl di terreno di coltura completo fresco.
      2. Per l'esterno dell'inserto (la piastra a 6 pozzetti), rimuovere 1 mL e aggiungere 1 mL di terreno di coltura fresco completo. Il 1 mL è stato scelto per la comodità di cambiare il terreno in un solo passaggio. Se lo si desidera, è possibile rimuovere e sostituire 1,25 ml.

Risultati

Figura 1: Assemblaggio del sistema di coltura prossimale.(A) Questo pannello mostra le cellule mesoteliali primarie umane (HPMC). (B) Questo pannello mostra le cellule di cancro ovarico HeyA8. Barre di scala = 200 μm (A-B). (C) Le cellule HeyA8 sono state seminate sulla superficie inferiore di un inserto transwell con pori di 0,4 μm. ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Supporto permeabile Transwell da 24 mm con inserto a membrana in policarbonato poroso da 0,4 μm	Corning (Costar)	Telefono 3412	• Membrana in policarbonato traslucido di 10 μm di spessore. • Trattato per un fissaggio ottimale delle celle. - Confezionato 6 inserti in una piastra a 6 pozzetti, 4 piastre per cassa. • La membrana deve essere colorata per garantire la visibilità cellulare. • Sterilizzato con radiazioni gamma.
Piastra a 6 pozzetti	Corning (Falco)	353046	Fondo piatto, trattato TC, sterile, con coperchio
Piatto di coltura da 15 cm	Corning (Falco)	353025	Piatto sterile per colture cellulari trattato con TC
DMEM	Corning (Cellgro)	10-013-CV
Penicillina Streptomicina	Corning	30-002-CI
MEM Aminoacidi non essenziali	Corning (Cellgro)	25-025-CI
Pipette			Qualsiasi marca va bene
Incubatore a CO2			Qualsiasi marca va bene
Armadio di biosicurezza livello II			Qualsiasi marca va bene