Sistema di coltura prossimale: una tecnica di coltura in vitro per studiare la segnalazione paracrina tra le cellule

Abstract

Fonte: Dasari, S. et al. Un metodo di coltura prossimale per studiare la segnalazione paracrina tra le cellule.J. Vis. Exp. (2018)

In questo video, sviluppiamo un modello di co-coltura prossimale di cellule tumorali ovariche e cellule mesoteliali umane primarie. Questo modello fisiologicamente rilevante consente lo studio della segnalazione paracrina, in cui le concentrazioni localizzate dei fattori secreti vengono mantenute impedendo il contatto cellulare diretto.

Protocollo

A. Preparazione delle cellule

1. Isolamento e coltura di cellule mesoteliali primarie umane
   1. Isolare le cellule mesoteliali primarie umane (HPMC) dall'omento umano e farle crescere in un terreno di crescita completo [Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) contenente il 10% di siero fetale bovino, l'1% di penicillina-streptomicina, l'1% di aminoacidi non essenziali e l'1% di vitamine] a 37 °C e il 5% di CO₂,
      nota: Le HPMC sono in genere coltivate al 100% di confluenza (Figura 1A).
2. Condizioni di crescita delle cellule tumorali ovar....

Risultati

Figura 1: Assemblaggio del sistema di coltura prossimale.(A) Questo pannello mostra le cellule mesoteliali primarie umane (HPMC). (B) Questo pannello mostra le cellule di cancro ovarico HeyA8. Barre di scala = 200 μm (A-B). (C) Le cellule HeyA8 sono state seminate sulla superficie inferiore di un inserto transwell con pori di 0,4 μm. .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Supporto permeabile Transwell da 24 mm con inserto a membrana in policarbonato poroso da 0,4 μm	Corning (Costar)	Telefono 3412	• Membrana in policarbonato traslucido di 10 μm di spessore. • Trattato per un fissaggio ottimale delle celle. - Confezionato 6 inserti in una piastra a 6 pozzetti, 4 piastre per cassa. • La membrana deve essere colorata per garantire la visibilità cellulare. • Sterilizzato con radiazioni gamma.
Piastra a 6 pozzetti	Corning (Falco)	353046	Fondo piatto, trattato TC, sterile, con coperchio
Piatto di coltura da 15 cm	Corning (Falco)	353025	Piatto sterile per colture cellulari trattato con TC
DMEM	Corning (Cellgro)	10-013-CV
Penicillina Streptomicina	Corning	30-002-CI
MEM Aminoacidi non essenziali	Corning (Cellgro)	25-025-CI
Pipette			Qualsiasi marca va bene
Incubatore a CO2			Qualsiasi marca va bene
Armadio di biosicurezza livello II			Qualsiasi marca va bene