Modellazione delle metastasi del cancro ovarico nel rivestimento della cavità peritoneale: un metodo per stabilire un modello 3D in vitro del rivestimento peritoneale

Abstract

Fonte: Peters, P. N. et al. Modellazione delle prime fasi della disseminazione del cancro ovarico in una coltura organotipica della cavità peritoneale umana. J. Vis. Exp. (2015)

In questo video, dimostriamo lo sviluppo di un modello tridimensionale in vitro del rivestimento della cavità peritoneale. Questa coltura organotipica può aiutare a studiare l'adesione, l'invasione e la proliferazione delle cellule tumorali ovariche.

Protocollo

1. Impiattare la Cultura Organotipica

1. Rilasciare NOF (fibroblasti omentali normali) da un pallone di coltura di 75 cm² risciacquando con 10 ml di PBS seguiti da 3 ml di tripsina allo 0,25%/25 mM EDTA per non più di 5 minuti. Neutralizzare la tripsina con almeno 3 volte il volume del terreno di crescita completo.
2. Trasferire le cellule tripsinizzate in una provetta conica da 50 ml e centrifugare a 0,5 g x 3 min. Rimuovere il surnatante e riportare le cellule in 5 ml di terreno di crescita completo. Utilizzare un contatore di cellule per contare le cellule recuperate dal pallone di coltura.
3. Diluire le cellule nel volume appropriato di terreno di coltura completo per ottenere una piastra di 2.000-4.000 NOF per 100 μl su una piastra nera, a fondo chiaro, a 96 pozzetti. Aggiungere 0,5 μg/100 μl di collagene I a coda di topo alla miscela cellulare prima della piastra. Lasciare riposare le celle a 37 °C in CO₂ al 5% in un ambiente umidificato per almeno 4 ore, o fino a quando le cellule aderiscono alla superficie della piastra.
4. Rilasciare le HPMC (cellule mesoteliali umane primarie) dal pallone di coltura utilizzando gli stessi metodi descritti nelle fasi 1.1 e 1.2. Diluire le cellule nella quantità appropriata di terreno di coltura completo per ottenere una piastra di 10.000-20.000 HPMC per 50 μl sopra il NOF già placcato con collagene I in piastre a 96 pozzetti. Lasciare riposare le celle a 37 °C in CO₂ al 5% in un ambiente umidificato per almeno 18 ore prima di iniziare gli esperimenti.
5. Colture di cellule di carcinoma ovarico HeyA8 che esprimono la proteina fluorescente verde (GFP) in terreni di crescita completi. Le cellule di carcinoma ovarico HeyA8 sono marcate in fluorescenza mediante l'espressione di un vettore lentivirale che esprime copepode cGFP (pCDH-CMV-MCS-EF1). Le cellule di cancro ovarico HeyA8 dovrebbero essere confluenti all'80-90% il giorno dell'uso (fase di crescita logaritmica). Rilasciare le cellule dalla piastra di coltura e contare utilizzando gli stessi metodi descritti nei passaggi 1.1-1.2 per le cellule primarie.
6. Lasciare che le cellule tumorali ovariche si riprendano in un terreno di crescita completo per 15-20 minuti a 37°C in una provetta conica con il coperchio ben chiuso.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Pbs	Fisher Scientifico	SH3001304
Piatti di coltura da 15 cm	BD Bioscienze	353025
DMEM con L-Glutammina	Corning	10-013-CV
Vitamine MEM	Corning	25-020-CL
MEM Aminoacidi non essenziali	Corning	25-025-CI
Penicillina-Streptomicina	Corning	30-002-CI
scuotitore	Termo-Fisher	MaxQ 4450
centrifuga	Eppendorf	Codice: 5702
incubatrice	Termo-Fisher	Forma Serie II Giacca ad acqua Incubatore a CO2 Modello 3100
Tripsina EDTA, 1x (0,25%)	Corning	25-053-CI
Fiasche T-75	BD Bioscienze	353136
Palloni T-175	BD Bioscienze	353112
Punte di pipette	Rainin	P2, P10, P20, P200 e P1000
Punte di pipette	Corning	Punte filtrate P2, P10, P20, P200 e P1000
Contatore di celle	Invitrogen	contessa
Camera di conteggio delle cellule della contessa Diapositive	Invitrogen	Codice C10313
Macchia Blu di Trypan (0.4%)	Gibco	Codice 15250-061
Collagene di tipo I (coda di ratto)	BD Bioscienze	354236
Piastra a 96 pozzetti, fondo trasparente, nera	BD Bioscienze	353219