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Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.
1. Isolamento e coltura di cellule stromali primarie non trasformate
- Raccolta e preparazione di tessuti umani.
- Prelevare campioni di omento umano, 2 cm3, rimossi durante un intervento chirurgico addominale, e immergere immediatamente il tessuto in soluzione salina tamponata con fosfato RT (PBS) (Figura 1A). Un pezzo di omento di 3 cm x 2 cm produce tipicamente 1 milione di cellule mesoteliali umane primarie (HPMC) e 200.000 fibroblasti umani primari o fibroblasti omentali normali (NOF).
- Centrifugare il PBS in cui è stato immerso il tessuto a 0,5 x g per 3 minuti il prima possibile dopo la raccolta (< 2 ore in PBS) e trasferire il tessuto in PBS fresco da 20 ml in una provetta conica da 50 ml. Tagliare il tessuto in pezzi da 5 mm3 tritandoli con bisturi in una piastra di coltura sterile di 15 cm di diametro (Figura 1B).
- Isolamento primario di cellule mesoteliali umane
- Per isolare l'HPMC, trasferire il tessuto tritato in provette coniche da 50 ml e attendere 1 minuto affinché i pezzi solidi galleggino verso l'alto (Figura 1C e D). HPMC e globuli rossi (RBC) saranno presenti nel liquido sul fondo. Utilizzare una pipetta per rimuovere il liquido dal fondo della provetta e inserirlo in una nuova provetta conica. Centrifugare il liquido a 0,5 x g per 3 minuti e aspirare il surnatante dal pellet HPMC/RBC.
- Ripetere il processo tre volte: aggiungere 20 ml di PBS al tessuto tritato, lasciare che il tessuto lieviti, rimuovere il liquido dal fondo con una pipetta e nella provetta HPMC/RBC, centrifugare e rimuovere il surnatante. Dopo che tutti i giri sono stati completati e il surnatante è stato aspirato, il pellet conterrà HPMC e RBC.
- Placcare tutte le cellule del pellet in un pallone da 75 cm2 in 15 ml di terreno di coltura completo (DMEM con il 10% di siero fetale bovino [FBS], l'1% di vitamine MEM [93 mg/L], l'1% di aminoacidi non essenziali MEM [81,4 mg/L], l'1% di penicillina streptomicina [Pen-Strep, 100 U/ml di penicillina e 100 μg/ml di streptomicina]).
- Eseguire un lavaggio PBS secondario per isolare ulteriori HPMC.
- Per il lavaggio secondario con PBS, agitare il tessuto solido rimanente a 200 giri/min, 37 °C per 10 minuti in 20 ml di PBS, quindi attendere 1 minuto affinché il tessuto galleggi verso l'alto. Rimuovere il liquido dal fondo della provetta in una nuova provetta, centrifugare a 0,5 x g per 3 minuti e aspirare il surnatante.
- Piastra tutto l'HPMC/RBC dal lavaggio PBS secondario in un pallone separato da 75 cm2 in 15 ml di terreno di coltura completo.
- Per isolare l'eventuale HPMC rimanente, agitare il tessuto tritato a 200 giri/min, 37 °C per 10 minuti in 20 ml di una soluzione 1:1 0,25% di tripsina 25 mM EDTA:PBS in volume. Lasciare lievitare il tessuto, raccogliere il liquido sul fondo della provetta in una nuova provetta da 50 ml e centrifugare a 0,5 x g per 3 minuti.
- Aspirare il surnatante e impiattare tutto l'HPMC/RBC in un pallone separato da 75 cm2 in 15 ml di terreno di coltura pieno.
- Coltivare le cellule piastrate a 37°C e 5% di CO2 in un ambiente umidificato. Alimentare le cellule piastrate aggiungendo 15 ml di terreno di coltura completo nei giorni 3 e 5 senza rimuovere il terreno esaurito. L'HPMC può essere coltivato per 5-7 giorni prima della scissione.
- Utilizzare l'HPMC a basso passaggio (fino al passaggio 2) in tutti gli esperimenti per ridurre al minimo la dedifferenziazione e la modifica del fenotipo originale. Utilizzare un microscopio a campo largo, preferibilmente con un obiettivo 20x con capacità di contrasto interferenziale differenziale in plastica o un obiettivo 4-20x con capacità di contrasto di fase (filtri a contrasto di fase sul microscopio) per scattare tutte le immagini delle cellule e un obiettivo 10x ()in campo chiaro per analizzare la colorazione immunoistochimica 3,3'-diaminobenzidina (DAB).
- Confermare che le HPMC sono cuboidali ed esprimono citocheratina 8 e vimentina eseguendo l'immunoistochimica (Figura 2A, C, E).
