Modellazione della colonizzazione cellulare del cancro ovarico dell'omento: un metodo ex vivo per stabilire la colonizzazione della macchia lattiginosa di cellule di cancro ovarico marcate in fluorescenza in espianti di omento murino

Abstract

Fonte: Krishnan, V. et al. Approcci in vivo ed ex vivo per studiare la colonizzazione metastatica del cancro ovarico delle strutture della macchia lattiginosa nel adiposo peritoneale. J. Vis. Exp. (2015)

In questo video, stabiliamo una coltura di organi omentali ex vivo sovrapposta a cellule di cancro ovarico che esprimono GFP per studiare la colonizzazione del cancro ovarico all'interno dell'espiante omentale. Questo protocollo analizza le strutture delle cellule immunitarie all'interno dell'omento, note come macchie lattiginose che promuovono le metastasi.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di JoVE.

1. Colonizzazione della macchia lattiginosa ex vivo

1. Determinazione delle condizioni di base ex vivo per la coltura di organi omentali
   1. Posizionare ciascun omento in un singolo inserto per piastra di coltura e posizionarlo all'interno di un pozzetto di una piastra per coltura tissutale a 12 pozzetti contenente 500 μl di terreno DME/F12 contenente il 20% di FCS. Mantenere le colture di organi a 37 °C in un ambiente con CO₂ al 5% per 24-48 ore e/o punti temporali aggiuntivi. Utilizzare tre omenta indipendenti (campioni triplicati) per ogni condizione (ad esempio, tipo di supporto/punto temporale).
   2. Per confermare l'integrità dei tessuti agli endpoint sperimentali, fissare ed elaborare i campioni come descritto nel passaggio 1.1.3. Il conteggio degli adipociti sani rispetto a quelli necrotici sulle sezioni H&E può valutare l'integrità dei tessuti. È necessario un minimo di ~120 cellule da cinque campioni biologici per formulare una percentuale di tessuto vivo presente.
   3. Per misurare la funzione tissutale, posizionare l'omenta (n=3) in pozzetti separati di una piastra a 24 pozzetti contenente 500 μl di terreno DME/F12 con il 20% di FCS. Lasciare che omenta condiziona il terreno a 37 °C in un ambiente con CO₂ al 5% per 24 ore, quindi rimuovere 250 μl per l'uso in un test ELISA IL-6.
2. Co-coltura ex vivo dell'omento di topo con cellule SKOV3ip.1-GFP
   1. Coltivare e preparare cellule marcate in fluorescenza pipettando 1x10⁶ cellule scongelate in 10 ml di terreno in un pallone T-75. Lasciare che le cellule crescano a 37 °C in un ambiente con CO₂ al 5% fino a raggiungere il 70% di confluenza. Tripsinizzare e risospendere ad una concentrazione di 2 x 10⁶ cellule per ml.
   2. Applicare ~6 μl di adesivo tissutale sulla membrana dell'inserto di coltura e lasciarlo asciugare all'aria. Lavare la membrana due volte con acqua sterile per rimuovere l'adesivo in eccesso. Asciugare le membrane all'aria sotto una cappa laminare.
   3. Asportare con cura l'omenta e fissarlo alla membrana rivestita di adesivo utilizzando una pinza sterile. Lasciare che il tessuto aderisca alla membrana per 1 minuto prima di aggiungere il terreno. Aggiungere 500 μl di sospensione cellulare sopra ciascun omento in ciascun inserto di coltura. Riempire l'area intorno alla camera del pozzetto con 2,5 ml di DME/F-12 .
   4. Incubare omenta con sospensione cellulare per 6 ore a 37 °C in un ambiente con CO_{2 al} 5%. Rimuovere e lavare con cura l'omenta con ~10 ml di PBS. Visualizzare i focolai di cellule tumorali fluorescenti utilizzando un sistema di imaging fluorescente appropriato.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Strumenti di dissezione	Strumenti per la scienza	Na
Geimsa	Fluka/Sigma Aldrich	Numero 48900
5% Formalina	sigma	HT501320
DMEM	Corning	10-013-CV
Pbs	Corning	21-040-CV	Senza calcio e magnesio
Collagenasi	Worthington	LS004196
Inserto per piastra di coltura millicell	Millipore	PICM01250
Cell-Tak	Corning	Codice 354240