Modellazione della colonizzazione cellulare del cancro ovarico dell'omento: un metodo ex vivo per stabilire la colonizzazione della macchia lattiginosa di cellule di cancro ovarico marcate in fluorescenza in espianti di omento murino

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di JoVE.

1. Colonizzazione della macchia lattiginosa ex vivo

1. Determinazione delle condizioni di base ex vivo per la coltura di organi omentali
   1. Posizionare ciascun omento in un singolo inserto per piastra di coltura e posizionarlo all'interno di un pozzetto di una piastra per coltura tissutale a 12 pozzetti contenente 500 μl di terreno DME/F12 contenente il 20% di FCS. Mantenere le colture di organi a 37 °C in un ambiente con CO₂ al 5% per 24-48 ore e/o punti temporali aggiuntivi. Utilizzare tre omenta indipendenti (campioni triplicati) per ogni condizione (ad esempio, tipo di supporto/punto temporale).
   2. Per confermare l'integrità dei tessuti agli endpoint sperimentali, fissare ed elaborare i campioni come descritto nel passaggio 1.1.3. Il conteggio degli adipociti sani rispetto a quelli necrotici sulle sezioni H&E può valutare l'integrità dei tessuti. È necessario un minimo di ~120 cellule da cinque campioni biologici per formulare una percentuale di tessuto vivo presente.
   3. Per misurare la funzione tissutale, posizionare l'omenta (n=3) in pozzetti separati di una piastra a 24 pozzetti contenente 500 μl di terreno DME/F12 con il 20% di FCS. Lasciare che omenta condiziona il terreno a 37 °C in un ambiente con CO₂ al 5% per 24 ore, quindi rimuovere 250 μl per l'uso in un test ELISA IL-6.
2. Co-coltura ex vivo dell'omento di topo con cellule SKOV3ip.1-GFP
   1. Coltivare e preparare cellule marcate in fluorescenza pipettando 1x10⁶ cellule scongelate in 10 ml di terreno in un pallone T-75. Lasciare che le cellule crescano a 37 °C in un ambiente con CO₂ al 5% fino a raggiungere il 70% di confluenza. Tripsinizzare e risospendere ad una concentrazione di 2 x 10⁶ cellule per ml.
   2. Applicare ~6 μl di adesivo tissutale sulla membrana dell'inserto di coltura e lasciarlo asciugare all'aria. Lavare la membrana due volte con acqua sterile per rimuovere l'adesivo in eccesso. Asciugare le membrane all'aria sotto una cappa laminare.
   3. Asportare con cura l'omenta e fissarlo alla membrana rivestita di adesivo utilizzando una pinza sterile. Lasciare che il tessuto aderisca alla membrana per 1 minuto prima di aggiungere il terreno. Aggiungere 500 μl di sospensione cellulare sopra ciascun omento in ciascun inserto di coltura. Riempire l'area intorno alla camera del pozzetto con 2,5 ml di DME/F-12 .
   4. Incubare omenta con sospensione cellulare per 6 ore a 37 °C in un ambiente con CO_{2 al} 5%. Rimuovere e lavare con cura l'omenta con ~10 ml di PBS. Visualizzare i focolai di cellule tumorali fluorescenti utilizzando un sistema di imaging fluorescente appropriato.