Ottenere cellule di cancro ovarico primario da campioni solidi: un metodo per coltivare cellule di cancro ovarico epiteliale da campioni di tumore ovarico

Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.

1. Lavorazione dei tessuti

1. Lavorando in condizioni sterili, trasferire i campioni su una piastra di Petri (60 mm x 60 mm) contenente 10 ml di PBS fresco e ghiacciato e, utilizzando una lama di rasoio sterile, ulteriormente tagliata nei pezzi più piccoli possibili (2 mm o meno) (Figure 1A e 1B).
2. Trasferire i tessuti tritati in una provetta conica da 15 ml contenente 10 ml di dispasi II (2,4 U/ml) preriscaldata (37 °C per 30 minuti) in DMEM e incubare al 5% di CO₂ e 37 °C per 30 minuti. Per garantire una digestione ottimale dei campioni, agitare manualmente l'impasto cellulare ogni 5 minuti.
3. Dopo 30 minuti di incubazione, trasferire (utilizzando una pipetta sierologica da 10 ml) il liquame cellulare su un colino cellulare (maglia da 70 μm) posto sopra una provetta conica da 50 ml e applicare una leggera pressione contro la rete utilizzando uno stantuffo della siringa. Scartare il tessuto non dissociato (rimasto sulla parte superiore della rete) e raccogliere la sospensione cellulare ottenuta nella provetta conica sterile da 50 ml. Centrifugare a 320 x g per 7 minuti a 4 °C (Figura 2).
4. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di DMEM contenente il 10% di FBS.
5. Incubare la sospensione cellulare in una piastra di Petri al 5% di CO₂ e 37 °C (Figura 3).
6. Cambiare il supporto dopo 24 ore dalla placcatura iniziale. Ciò consente la rimozione dei detriti cellulari e della maggior parte degli eritrociti presenti nella coltura.
7. Cambiare il terreno ogni tre giorni per le due settimane successive, dopodiché le colture dell'EOC primario sono pronte per le applicazioni a valle.

Figura 1. Elaborazione di campioni clinici. A) Campione solido trasferito su una piastra di Petri contenente 10 ml di 1x PBS fresco e ghiacciato. B) Campioni clinici ulteriormente tagliati in pezzi di circa 2 mm di dimensione

Figura 2. Separazione di cellule EOC da tessuti non dissociati. Dopo la digestione enzimatica, i campioni clinici vengono trasferiti su un colino cellulare e viene applicata una leggera pressione sui campioni clinici digeriti utilizzando uno stantuffo della siringa. Ciò consente il distacco meccanico dell'EOC dai tessuti connettivi e il recupero delle cellule EOC

Figura 3. Placcatura della sospensione di cellule EOC risultanti. Dopo aver rimosso i tessuti non dissociati, la sospensione cellulare viene centrifugata e risospesa in 10 ml di DMEM contenente il 10% di FBS e incubata in una piastra di Petri al 5% di CO2 e 37 °C