Ottenere cellule di cancro ovarico primario da campioni solidi: un metodo per coltivare cellule di cancro ovarico epiteliale da campioni di tumore ovarico

Abstract

Fonte: Pribyl, L. J. et al. Metodo per ottenere cellule di cancro ovarico primario da campioni solidi. J. Vis. Exp. (2014)

In questo video, descriviamo un metodo per isolare e caratterizzare le cellule di cancro ovarico primario da campioni di tessuto tumorale ovarico solido. Le cellule tumorali epiteliali ottenute utilizzando questo protocollo sono adatte per comprendere i processi che possono portare all'inizio e allo sviluppo del cancro ovarico.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.

1. Lavorazione dei tessuti

1. Lavorando in condizioni sterili, trasferire i campioni su una piastra di Petri (60 mm x 60 mm) contenente 10 ml di PBS fresco e ghiacciato e, utilizzando una lama di rasoio sterile, ulteriormente tagliata nei pezzi più piccoli possibili (2 mm o meno) (Figure 1A e 1B).
2. Trasferire i tessuti tritati in una provetta conica da 15 ml contenente 10 ml di dispasi II (2,4 U/ml) preriscaldata (37 °C per 30 minuti) in DMEM e incubare al 5% di CO₂ e 37 °C per 30 minuti. Per garantire una digestione ottimale dei campioni, agitare manualmente l'impasto cellulare ogni 5 minuti.
3. Dopo 30 minuti di incubazione, trasferire (utilizzando una pipetta sierologica da 10 ml) il liquame cellulare su un colino cellulare (maglia da 70 μm) posto sopra una provetta conica da 50 ml e applicare una leggera pressione contro la rete utilizzando uno stantuffo della siringa. Scartare il tessuto non dissociato (rimasto sulla parte superiore della rete) e raccogliere la sospensione cellulare ottenuta nella provetta conica sterile da 50 ml. Centrifugare a 320 x g per 7 minuti a 4 °C (Figura 2).
4. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di DMEM contenente il 10% di FBS.
5. Incubare la sospensione cellulare in una piastra di Petri al 5% di CO₂ e 37 °C (Figura 3).
6. Cambiare il supporto dopo 24 ore dalla placcatura iniziale. Ciò consente la rimozione dei detriti cellulari e della maggior parte degli eritrociti presenti nella coltura.
7. Cambiare il terreno ogni tre giorni per le due settimane successive, dopodiché le colture dell'EOC primario sono pronte per le applicazioni a valle.

Risultati

Figura 1. Elaborazione di campioni clinici. A) Campione solido trasferito su una piastra di Petri contenente 10 ml di 1x PBS fresco e ghiacciato. B) Campioni clinici ulteriormente tagliati in pezzi di circa 2 mm di dimensione

Fig...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1x PBS, sterile	Invitrogen	Codice 14190-144
Coperchio a vite, polipropilene provino per contenitori, sterile	Termo Scientifico
Terreno DMEM, sterile	Invitrogen	Codice 11995-065
Siero fetale bovino, sterile	Thermo Scientific Hyclone	SH30396.03
100x Penicillina-streptomicina, liquida	Invitrogen	Codice: 15140-122
Dispasi II, sterile	Roche	Codice 04942 078 001
Piccole pinze a punta fine e bisturi a lama, sterile	Fisher Scientifico	pinze: 08-953E, lame: 08-927-5D
Forbici da dissezione piccole, sterili	Fisher Scientifico	08-945
Provette coniche con tappo da 15 ml, sterili	Falco BD	352097
Provette coniche con tappo da 50 ml, sterili	Falco BD	352027
Pipetta sierologica da 10 ml, sterile	Corning	13-678-11E
Pistone per siringa da 6 ml, sterile	Tyco Sanità	8881516911
Filtro in nylon (70 μm) filtro cellulare, sterile	Falco BD	Codice 352350
Piastra Petri da 5 cm, sterile	Corning	430166
Piastra Petri da 10 cm, sterile	Corning	430167