1. Formazione di sferoidi cellulari di cancro ovarico
Le - cellule di carcinoma ovarico che esprimono RFP vengono coltivate in terreno base al 10% (un terreno di coltura cellulare personalizzato contenente una miscela 50:50 di 199 e MCDB105, il 10% di siero fetale bovino inattivato e l'1% di pen-streptococco). Per esprimere RFP in cellule di carcinoma ovarico non marcate, trasfettare le cellule con un plasmide contenente RFP e selezionare le cellule che esprimono RFP. In alternativa, i vettori virali possono essere utilizzati per esprimere le proteine fluorescenti in modo transitorio, oppure le cellule possono essere pre-incubate con un colorante tracciatore di cellule fluorescenti rosse (Invitrogen).
- Prima di formare sferoidi per carcinoma ovarico, è necessario preparare piastre di coltura a fondo tondo a 96 pozzetti a bassa aderenza. Per produrre piastre di coltura a bassa aderenza, aggiungere 30 μL di soluzione di poli-HEMA (6 mg di poliidrossietilmetacrilato in 1 ml di EtOH al 95%) a ciascun pozzetto di una piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti. Le piastre da 96 pozzetti vengono incubate in un incubatore non umidificato a 37 °C per far evaporare l'etanolo, lasciando un film di poli-HEMA su ciascun pozzetto. Questo film in poli-HEMA impedisce alle cellule di attaccarsi al fondo del pozzetto, costringendo le cellule a crescere in sospensione. [In alternativa, è possibile utilizzare piastre di coltura con attacco ultrabasso (Corning).]
- Successivamente, tripsinizzare le cellule tumorali ovariche, pellettare le cellule in una centrifuga da tavolo (Heraeus) a 900 RCF per 3 minuti. Aspirare il surnatante e risospendere in 10% di Base Medium.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro.
- Regolare la concentrazione delle cellule in modo che ci siano 100 cellule per 50 μl di terreno base al 10%.
- Aggiungere 50 μl della sospensione cellulare diluita uniformemente sospesa a ciascun pozzetto della piastra di coltura rivestita in poli-HEMA a 96 pozzetti.
- Incubare la piastra a 96 pozzetti in un incubatore per colture cellulari a 37 °C per 16 ore (questo periodo di tempo deve essere aumentato o diminuito a seconda del tempo necessario a una particolare linea cellulare per formare sferoidi multicellulari o delle condizioni sperimentali desiderate) per consentire alle cellule del cancro ovarico di raggrupparsi, formando un singolo sferoide multicellulare in ciascun pozzetto. Alcune cellule tumorali possono andare incontro ad apoptosi durante questo periodo, quindi è essenziale scegliere un momento prima dell'induzione dell'apoptosi.
2. Formazione del Monostrato di Cellule Mesoteliali
- In una cappa per colture cellulari, rivestire preventivamente i pozzetti di una piastra MatTek a 6 pozzetti con fondo di vetro con fibronectina aggiungendo 2 mL di una soluzione di fibronectina da 5 μg/mL di PBS a ciascun pozzetto della piastra e incubando a temperatura ambiente per 30 minuti. La qualità ottica dei fondi in vetro delle piastre MatTek consente l'imaging microscopico ad alta risoluzione.
- Le cellule mesoteliali che esprimono GFP sono coltivate in terreno base al 10%. Tripsinizzare una piastra di cellule mesoteliali, centrifugare in una centrifuga da tavolo (Heraeus) a 900 giri/min per 3 minuti, aspirare il surnatante e risospendere in terreno basico al 10%. Le cellule mesoteliali utilizzate qui esprimevano già GFP quando sono state ottenute, ma le cellule mesoteliali non marcate possono essere prodotte trasfettando con un plasmide contenente cDNA GFP o pre-incubando le cellule in un colorante tracciante cellulare fluorescente verde (Invitrogen).
- Dopo l'incubazione della fibronectina di 30 minuti (al punto 2.1), lavare i pozzetti della capsula MatTek con 2 ml di PBS.
- Aspirare il PBS e la piastra 6 x105 celle mesoteliali per pozzetto in ciascun pozzetto della capsula MatTek a 6 pozzetti. Incubare la piastra MatTek in un incubatore per colture cellulari a 37 °C durante la notte per consentire alle cellule mesoteliali di attaccarsi alla piastra e formare un monostrato.
3. Saggio di clearance delle cellule mesoteliali
- Utilizzare una pipetta per raccogliere gli sferoidi del cancro ovarico dalla piastra rivestita in poli-HEMA a 96 pozzetti.
- Aspirare il terreno da un pozzetto della piastra MatTek a 6 pozzetti contenente un monostrato di cellule mesoteliali. Lavare una volta con 2 ml di PBS. Aggiungi tutti gli sferoidi dalla piastra a 96 pozzetti a un pozzetto della piastra MatTek (~3 volte il numero di sferoidi che verranno ripresi per tenere conto degli sferoidi che atterrano sulla parte della piastra che non può essere visualizzata).
- Posizionare la capsula MatTek sul tavolino di un microscopio a fluorescenza a campo largo invertito in grado di eseguire l'imaging time-lapse per la durata di almeno 8 ore. Utilizza un tavolino motorizzato per visualizzare più posizioni nella parabola, con più eventi di intercalazione sferoidale, in un unico esperimento. Utilizziamo un microscopio time-lapse a fluorescenza a campo largo motorizzato invertito Nikon Ti-E con sistema di messa a fuoco perfetto integrato e ottica a basso ingrandimento [20x-0,75 con apertura numerica (NA)]/contrasto di interferenza differenziale NA (DIC), un transilluminatore alogeno Nikon con condensatore a lunga distanza di lavoro (LWD) da 0,52 NA, filtri di eccitazione ed emissione rapidi Nikon (tempo di commutazione di <100 millisecondi) (GFP Ex 480/40, Em 525/50, RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50), otturatori intelligenti Sutter a trasmissione rapida e percorso della luce in epifluorescenza, un tavolino motorizzato con codifica lineare Nikon, una fotocamera con dispositivo ad accoppiamento di carica (CCD) raffreddato Hamamatsu ORCA-AG, una camera di incubazione per microscopio personalizzata con controllo della temperatura e della CO2, software Nikon NIS-Elements AR versione 3 e una tabella di isolamento dalle vibrazioni TMC.
- Gli sferoidi delle cellule tumorali ovariche si depositeranno sul fondo del piatto e si attaccheranno al monostrato di cellule mesoteliali. Raccogli immagini GFP, RFP e di fase di 20+ interazioni sferoidi/monostrato ogni 10 minuti, per 8 ore.
- Gli sferoidi delle cellule tumorali ovariche che esprimono RFP invaderanno il monostrato di cellule mesoteliali che esprimono GFP, creando un buco nel monostrato. Dopo 8 ore, misurare le dimensioni dei fori tracciando i buchi neri nelle immagini GFP utilizzando il software Elements (o un altro software adatto come l'immagine J). Normalizzare la dimensione del foro alla dimensione iniziale dello sferoide dividendo la dimensione del foro a 8 ore per la dimensione dello sferoide nell'immagine RFP corrispondente al tempo zero. In questo esempio, la dimensione del foro è stata misurata solo una volta, ma può essere misurata più volte durante l'esperimento di otto ore per comprendere meglio la dinamica dell'intercalazione.
