Determinazione della frequenza di campo ottimale per il trattamento dei tumori inibitori per le cellule tumorali: un metodo in vitro non invasivo per valutare l'effetto dei TTFields sulla vitalità delle cellule tumorali

1. Sistema di Applicazione In Vitro TTFields - Manutenzione della Piastra di Base e della Piastra

1. Sciacquare i piatti e i copripiatti sotto l'acqua corrente del rubinetto. Quindi, risciacquare con acqua deionizzata e asciugare all'aria a faccia in giù.
2. Se un agente/farmaco chemioterapico è stato aggiunto ai piatti in un esperimento precedente, riempire ogni piatto con una soluzione detergente leggera al 5% e lasciare riposare per una notte.
   1. Sciacquare accuratamente le stoviglie sotto l'acqua corrente del rubinetto per evitare tracce di detersivo all'interno della piastra. Sciacquare i piatti e i copripiatti con acqua deionizzata e asciugarli all'aria a faccia in giù.
3. Inserire le stoviglie pulite e asciutte con i loro coperchi nei sacchetti di sterilizzazione. Sigillare e posizionare i sacchetti in autoclave, con le stoviglie rivolte verso il basso. Autoclavare per 30 minuti a una temperatura non superiore a 121 °C.
4. Impostare l'autoclave su un programma a secco, aprire parzialmente lo sportello dell'autoclave e asciugare le stoviglie per 30 minuti.
5. Pulire la piastra di base con un panno leggermente inumidito con etanolo al 70%.

2. Configurazione dell'esperimento

NOTA: Tutte le attrezzature e i materiali utilizzati in questo protocollo sono descritti nell'elenco dei materiali. Tutti i passaggi seguenti devono essere eseguiti all'interno di una cabina a flusso laminare mantenendo le condizioni di sterilità.

1. Preparare i piatti e i coperchi TTFields puliti e sterili, come descritto nella sezione 1. Pulire la piastra di base con un panno leggermente inumidito con etanolo al 70%.
2. Installare le piastre TTFields con i coperchi sulla piastra di base premendo delicatamente sulla piastra e ruotandole in senso orario di circa 5 mm fino a quando il bordo della piastra non si blocca sui tre perni sulla piastra di base. Posizionare un vetrino coprioggetti sterile da 22 mm (plastica trattata o vetro) sul fondo di ogni piatto.
3. Preparare la sospensione cellulare in terreno di crescita completo (terreno di Eagle modificato di Dulbecco per U-87 MG e F98; RPMI per A2780 e OVCAR-3; integrato come descritto nell'elenco dei materiali).
   NOTA: Le concentrazioni cellulari dipendono dai tipi di cellule e dalla durata dell'esperimento; La crescita cellulare confluente dell'80%-90% non deve essere superata entro la fine dell'esperimento.
   ATTENZIONE: Le linee cellulari umane possono rappresentare un pericolo biologico e devono essere maneggiate con le misure di sicurezza appropriate.
4. Posizionare 200 μl di sospensione cellulare (di solito 5.000-20.000 cellule in 200 μl per un esperimento di 72 ore, a seconda del tempo di raddoppio) come goccia al centro di ciascun vetrino coprioggetti e coprire con i coperchi delle stoviglie.
5. Incubare a 37 °C in un incubatore di CO₂ fino a quando le cellule aderiscono; in questa fase è possibile un'incubazione notturna.
6. Aspirare i liquidi dalla goccia utilizzando una pipetta da 200 o 1.000 μl.
7. Pipettare delicatamente 2 mL di terreno di coltura completo per riempire ogni piatto. Utilizzare una punta sterile per pipettare e picchiettare delicatamente sui bordi del vetrino coprioggetti per rilasciare le bolle d'aria occasionalmente intrappolate sotto il vetrino.
8. Coprire le piastre con i loro coperchi e posizionarle all'interno di un incubatore di CO₂ a 37 °C fino all'inizio del trattamento TTFields.

3. Applicazione TTFields

1. Trasferire le piastre di base con le piastre TTFields attaccate in un'incubatrice refrigerata a CO₂.
   NOTA: L'applicazione in vitro di TTFields genererà calore; Pertanto, è necessaria un'incubatrice refrigerata per compensare il riscaldamento delle stoviglie. Intensità TTFields più elevate produrranno più calore e richiederanno temperature ambiente dell'incubatore più basse (vedi Tabella 1). Le intensità clinicamente rilevanti dei TTFields si ottengono quando la temperatura dell'incubatore per l'applicazione dei TTFields è compresa tra 18 e 30 °C.
2. Collegare il connettore femmina del cavo piatto alla piastra di base. Accendere il generatore TTFields.
3. Avviare il software del sistema applicativo in vitro TTFields e selezionare le impostazioni dell'esperimento.
   1. Definire un nuovo esperimento. Digitare il nome dell'esperimento e il proprietario dell'esperimento nell'interfaccia utente del software sullo schermo del computer. Regolare la frequenza e la temperatura target per ogni piatto o piastra di base.
4. Avviare l'applicazione TTFields utilizzando il software.
5. Verificare che tutte le parabole siano collegate correttamente e appaiano azzurre sul monitor. Se una parabola è cerchiata con una cornice rossa (il che significa che non è collegata correttamente), premerla delicatamente verso il basso e ruotarla lentamente avanti e indietro fino a quando i contatti non vengono ripristinati e la parabola appare azzurra.
6. Lasciare in funzione il sistema di applicazione in vitro TTFields per un massimo di 24 ore.
7. Se l'esperimento raggiunge il suo punto finale, interrompi l'esperimento facendo clic sul pulsante TERMINA ESPERIMENTO nel software e procedi al passaggio 5. In caso contrario, fai clic su METTI PAUSA esperimento.
8. Scollegare il connettore del cavo piatto dalla piastra di base. Rimuovere la piastra di base con le piastre dall'incubatrice in una camera a flusso laminare.
9. Sostituire il fluido in tutte le stoviglie ogni 24 ore e rimettere la piastra di base nell'incubatrice refrigerata. Collegare la piastra di base al generatore utilizzando il cavo piatto. Continua l'esperimento facendo clic sul pulsante CONTINUA.

Tabella 1. Temperatura ambiente dell'incubatore e intensità attese dei TTFields all'interno della capsula TTFields.

4. Campioni di controllo

Nota: Coltiva le cellule di controllo in condizioni simili alle cellule trattate con TTFields, esclusa l'applicazione di TTFields.

1. Campioni di controllo su piastra con la stessa sospensione e su una superficie simile utilizzati per la placcatura di campioni trattati con TTFields.
2. Porre le piastre di controllo in un incubatore a CO₂ a 37 °C.
3. Sostituire il fluido nelle piastre ogni 24 ore in modo che corrisponda alle condizioni del fluido delle piastre trattate con TTFields.

5. Fine dell'esperimento

1. Dopo aver cliccato su TERMINA ESPERIMENTO, attendi che il software recuperi tutti i record dal sistema e salvi i record sul computer.
2. Utilizzare il pulsante RAPPORTI per rivedere i file di registro della temperatura, della corrente e della resistenza di ciascuna piastra di base per verificare che tutte le piastre siano state trattate secondo il piano sperimentale.
   NOTA: tutti i rapporti e i registri vengono salvati sul computer dopo la fine dell'esperimento e possono essere rivisti in qualsiasi momento.
3. Spegnere il generatore TTFields.
4. Scollegare il cavo piatto dalla piastra di base e rimuoverlo dall'incubatrice.
5. Per rimuovere un piatto in ceramica, premere e ruotare il piatto in senso antiorario per sbloccarlo dalla piastra di base.
6. Portare le piastre in una camera a flusso laminare e rimuovere asetticamente i vetrini. Trasferirli in piastre di Petri sterili contenenti terreno fresco o soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per ulteriori ispezioni e valutazioni.