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1. Sistema di Applicazione In Vitro TTFields - Manutenzione della Piastra di Base e della Piastra
- Sciacquare i piatti e i copripiatti sotto l'acqua corrente del rubinetto. Quindi, risciacquare con acqua deionizzata e asciugare all'aria a faccia in giù.
- Se un agente/farmaco chemioterapico è stato aggiunto ai piatti in un esperimento precedente, riempire ogni piatto con una soluzione detergente leggera al 5% e lasciare riposare per una notte.
- Sciacquare accuratamente le stoviglie sotto l'acqua corrente del rubinetto per evitare tracce di detersivo all'interno della piastra. Sciacquare i piatti e i copripiatti con acqua deionizzata e asciugarli all'aria a faccia in giù.
- Inserire le stoviglie pulite e asciutte con i loro coperchi nei sacchetti di sterilizzazione. Sigillare e posizionare i sacchetti in autoclave, con le stoviglie rivolte verso il basso. Autoclavare per 30 minuti a una temperatura non superiore a 121 °C.
- Impostare l'autoclave su un programma a secco, aprire parzialmente lo sportello dell'autoclave e asciugare le stoviglie per 30 minuti.
- Pulire la piastra di base con un panno leggermente inumidito con etanolo al 70%.
2. Configurazione dell'esperimento
NOTA: Tutte le attrezzature e i materiali utilizzati in questo protocollo sono descritti nell'elenco dei materiali. Tutti i passaggi seguenti devono essere eseguiti all'interno di una cabina a flusso laminare mantenendo le condizioni di sterilità.
- Preparare i piatti e i coperchi TTFields puliti e sterili, come descritto nella sezione 1. Pulire la piastra di base con un panno leggermente inumidito con etanolo al 70%.
- Installare le piastre TTFields con i coperchi sulla piastra di base premendo delicatamente sulla piastra e ruotandole in senso orario di circa 5 mm fino a quando il bordo della piastra non si blocca sui tre perni sulla piastra di base. Posizionare un vetrino coprioggetti sterile da 22 mm (plastica trattata o vetro) sul fondo di ogni piatto.
- Preparare la sospensione cellulare in terreno di crescita completo (terreno di Eagle modificato di Dulbecco per U-87 MG e F98; RPMI per A2780 e OVCAR-3; integrato come descritto nell'elenco dei materiali).
NOTA: Le concentrazioni cellulari dipendono dai tipi di cellule e dalla durata dell'esperimento; La crescita cellulare confluente dell'80%-90% non deve essere superata entro la fine dell'esperimento.
ATTENZIONE: Le linee cellulari umane possono rappresentare un pericolo biologico e devono essere maneggiate con le misure di sicurezza appropriate.
- Posizionare 200 μl di sospensione cellulare (di solito 5.000-20.000 cellule in 200 μl per un esperimento di 72 ore, a seconda del tempo di raddoppio) come goccia al centro di ciascun vetrino coprioggetti e coprire con i coperchi delle stoviglie.
- Incubare a 37 °C in un incubatore di CO2 fino a quando le cellule aderiscono; in questa fase è possibile un'incubazione notturna.
- Aspirare i liquidi dalla goccia utilizzando una pipetta da 200 o 1.000 μl.
- Pipettare delicatamente 2 mL di terreno di coltura completo per riempire ogni piatto. Utilizzare una punta sterile per pipettare e picchiettare delicatamente sui bordi del vetrino coprioggetti per rilasciare le bolle d'aria occasionalmente intrappolate sotto il vetrino.
- Coprire le piastre con i loro coperchi e posizionarle all'interno di un incubatore di CO2 a 37 °C fino all'inizio del trattamento TTFields.
3. Applicazione TTFields
- Trasferire le piastre di base con le piastre TTFields attaccate in un'incubatrice refrigerata a CO2.
NOTA: L'applicazione in vitro di TTFields genererà calore; Pertanto, è necessaria un'incubatrice refrigerata per compensare il riscaldamento delle stoviglie. Intensità TTFields più elevate produrranno più calore e richiederanno temperature ambiente dell'incubatore più basse (vedi Tabella 1). Le intensità clinicamente rilevanti dei TTFields si ottengono quando la temperatura dell'incubatore per l'applicazione dei TTFields è compresa tra 18 e 30 °C.
- Collegare il connettore femmina del cavo piatto alla piastra di base. Accendere il generatore TTFields.
- Avviare il software del sistema applicativo in vitro TTFields e selezionare le impostazioni dell'esperimento.
- Definire un nuovo esperimento. Digitare il nome dell'esperimento e il proprietario dell'esperimento nell'interfaccia utente del software sullo schermo del computer. Regolare la frequenza e la temperatura target per ogni piatto o piastra di base.
- Avviare l'applicazione TTFields utilizzando il software.
- Verificare che tutte le parabole siano collegate correttamente e appaiano azzurre sul monitor. Se una parabola è cerchiata con una cornice rossa (il che significa che non è collegata correttamente), premerla delicatamente verso il basso e ruotarla lentamente avanti e indietro fino a quando i contatti non vengono ripristinati e la parabola appare azzurra.
- Lasciare in funzione il sistema di applicazione in vitro TTFields per un massimo di 24 ore.
- Se l'esperimento raggiunge il suo punto finale, interrompi l'esperimento facendo clic sul pulsante TERMINA ESPERIMENTO nel software e procedi al passaggio 5. In caso contrario, fai clic su METTI PAUSA esperimento.
- Scollegare il connettore del cavo piatto dalla piastra di base. Rimuovere la piastra di base con le piastre dall'incubatrice in una camera a flusso laminare.
- Sostituire il fluido in tutte le stoviglie ogni 24 ore e rimettere la piastra di base nell'incubatrice refrigerata. Collegare la piastra di base al generatore utilizzando il cavo piatto. Continua l'esperimento facendo clic sul pulsante CONTINUA.
| Temperatura ambiente dell'incubatore | Intensità previste dei TTFields |
| (°C) | (V/cm RMS) |
| 18 | 1.62 |
| 19 | 1,55 |
| 20 | 1.48 |
| 21 | 1.41 |
| 22 | 1.33 |
| 23 | 1.26 |
| 24 | 1.19 |
| 25 | 1.12 |
| 26 | 1.04 |
| 27 | 0,97 |
| 28 | 0,9 |
| 29 | 0,83 |
| 30 | 0,76 |
Tabella 1. Temperatura ambiente dell'incubatore e intensità attese dei TTFields all'interno della capsula TTFields.
4. Campioni di controllo
Nota: Coltiva le cellule di controllo in condizioni simili alle cellule trattate con TTFields, esclusa l'applicazione di TTFields.
- Campioni di controllo su piastra con la stessa sospensione e su una superficie simile utilizzati per la placcatura di campioni trattati con TTFields.
- Porre le piastre di controllo in un incubatore a CO2 a 37 °C.
- Sostituire il fluido nelle piastre ogni 24 ore in modo che corrisponda alle condizioni del fluido delle piastre trattate con TTFields.
5. Fine dell'esperimento
- Dopo aver cliccato su TERMINA ESPERIMENTO, attendi che il software recuperi tutti i record dal sistema e salvi i record sul computer.
- Utilizzare il pulsante RAPPORTI per rivedere i file di registro della temperatura, della corrente e della resistenza di ciascuna piastra di base per verificare che tutte le piastre siano state trattate secondo il piano sperimentale.
NOTA: tutti i rapporti e i registri vengono salvati sul computer dopo la fine dell'esperimento e possono essere rivisti in qualsiasi momento.
- Spegnere il generatore TTFields.
- Scollegare il cavo piatto dalla piastra di base e rimuoverlo dall'incubatrice.
- Per rimuovere un piatto in ceramica, premere e ruotare il piatto in senso antiorario per sbloccarlo dalla piastra di base.
- Portare le piastre in una camera a flusso laminare e rimuovere asetticamente i vetrini. Trasferirli in piastre di Petri sterili contenenti terreno fresco o soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per ulteriori ispezioni e valutazioni.