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Tutte le procedure che coinvolgono embrioni di uova di gallina sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di JoVE.
1. Preparare le uova
- Prima di ricevere le uova, assemblare ed equilibrare l'incubatrice a 37.8 °C (100 °F) con un'umidità del 60-70% seguendo le istruzioni del produttore.
nota: Per ridurre al minimo i rischi di contaminazione, è possibile utilizzare acqua autoclavata per controllare l'umidità.
- Dopo aver ricevuto le uova di gallina Rhode Island Red fecondate da un fornitore di uova certificato da laboratorio, pulire a secco la superficie dei gusci con carta assorbente. Un tovagliolo di carta leggermente inumidito può essere utilizzato per rimuovere il materiale aderito. Asciugare immediatamente.
nota: Bagnare il guscio con un liquido a una temperatura inferiore a 43,3 °C può introdurre batteri nell'uovo. Se si sceglie di lavare o disinfettare le uova, la temperatura del liquido deve essere compresa tra 43,3 e 48,9 °C. Temperature più elevate possono far bollire le uova. La scelta del disinfettante deve essere fatta in base ai microrganismi che destano preoccupazione.
- Usa una matita o un pennarello per etichettare la data sull'uovo. Questo è considerato il giorno 0 dello sviluppo.
- Mettere le uova nell'incubatrice e incubare per almeno 7 giorni con rotazione per consentire lo sviluppo della CAM. Può essere utilizzato un rotatore automatico, oppure le uova possono essere ruotate di 180° 2-3 volte al giorno.
2. Aprire le uova
NOTA: L'apertura delle uova dovrebbe essere effettuata quando il CAM è completamente sviluppato. Questo è in genere il giorno di sviluppo 7 o 8.
- Disinfettare una cabina di biosicurezza con etanolo al 70%. Allo stesso modo, disinfettare e posizionare nell'armadio di biosicurezza un portauova, un candelabro per uova, un pennarello, un utensile rotante a batteria con una mola in carburo di silicio e una mola da taglio circolare, un ago da 18 G, un controller per pipette con tubo a vuoto da un quarto di pollice, nastro da imballaggio, forbici da ufficio, forbici curve, pinze Semken (o simili), batuffoli di cotone e una medicazione in pellicola trasparente da 6 x 7 cm. Quando possibile, utilizzare strumenti sterili, monouso o autoclavati.
- Spegni il rotatore di uova. Mettere circa 1-3 uova nell'armadio di biosicurezza sulla griglia per uova. Mentre sei al buio, posiziona il candelabro dell'uovo contro il guscio dell'uovo per identificare la cella d'aria. Segnare la posizione della cella d'aria.
nota: L'intensità dell'illuminazione del candelabro è fondamentale per visualizzare l'interno dell'uovo. Se la cella d'aria o il sistema vascolare sono costantemente difficili da vedere, prova a sostituire le batterie del candelabro delle uova.
- Sposta il candelabro delle uova sul guscio per trovare una grande rete di vasi sanguigni. Ruotare l'uovo se necessario. Una vascolarizzazione ideale si ramifica vicino al centro dell'uovo. Utilizzare un pennarello per disegnare sulla vascolarizzazione da utilizzare per l'impianto.
- Accendi la luce nella cappa. Utilizzando un utensile rotante a batteria dotato di una mola abrasiva in carburo di silicio, praticare un piccolo foro nel guscio direttamente sopra il centro della cella d'aria. Forare fino a quando la maggior parte del guscio è stata rimossa, ma la membrana interna bianca è intatta><.
nota: La perforazione della cella d'aria prima di mirare al sistema vascolare consente di determinare lo spessore di quel particolare guscio d'uovo sopra la cella d'aria piuttosto che sopra il CAM e il sistema vascolare. Se la CAM o la vascolarizzazione sono interrotte, l'ovulo non è utilizzabile per l'impianto.
- Praticare e aprire un altro piccolo foro dove verrà aperta la finestra vascolare come è stato fatto per la cella d'aria (passaggio 2.4).
- Utilizzando un ago da 18 G, perforare delicatamente la membrana interna bianca sopra la cella d'aria e il sistema vascolare. Se non riesci a penetrare il guscio, perfora con attenzione un po' di più. Assicurarsi che la membrana interna bianca (ma non la CAM) sia interrotta in tutta l'area perforata. La rimozione del pezzo di membrana non è necessaria.
nota: Se la CAM o il sistema vascolare vengono interrotti durante questa fase, scartare l'uovo. Il danno è evidente se c'è sangue o albumina che fuoriesce da un foro praticato.
- Spegnere la luce del cofano. Utilizzando il candelabro per uova, verificare che la cella d'aria sia stata trasferita dall'estremità dell'uovo all'area sopra il sistema vascolare. Se necessario, posizionare il tubo del vuoto inserito in un controller per pipette attorno al foro sopra la cella d'aria originale e applicare delicatamente l'aspirazione a brevi raffiche per spostare la cella d'aria.
- Utilizzare un pennarello per delineare la nuova posizione della cella d'aria a circa 0,5 cm all'interno del confine air-CAM. Attacca un pezzo di nastro adesivo appena sopra la nuova cella d'aria. Se necessario, utilizzare le normali forbici da ufficio per tagliare il nastro a una dimensione appropriata.
nota: Il nastro può interrompere il flusso d'aria attraverso il guscio e non deve essere più grande del necessario per coprire completamente la cella d'aria.
- Rimetti le uova nell'incubatrice per riscaldarle senza ruotarle con la nuova cella d'aria rivolta verso l'alto. Ripetere i passaggi 2.2-2.9 per le uova rimanenti da aprire.
nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Se non si è sicuri della qualità dello sviluppo della CAM, un piccolo numero di uova dovrebbe procedere attraverso il passaggio 2.16 prima di aprire le uova rimanenti.
- Posizionare circa 1-3 uova con celle d'aria riposizionate sul rack per uova nell'armadio di biosicurezza.
nota: Bisogna fare attenzione per evitare di introdurre contaminazioni nell'uovo aperto. Pertanto, aprire sempre le uova all'interno di una cappa di biosicurezza e utilizzare strumenti e attrezzature sterili quando possibile.
- Utilizzando un utensile rotante a batteria dotato di un disco da taglio circolare, tagliare una piccola linea sul confine della cella d'aria tracciata al punto 2.8. Assicurarsi che questo sia di circa 0,5 cm all'interno del limite effettivo dell'air-CAM per evitare di interrompere la CAM o il sistema vascolare. Tagliare completamente il guscio, ma fare attenzione a non penetrare abbastanza in profondità da interrompere la CAM o il sistema vascolare.
- Usando le forbici curve, taglia intorno alla cella d'aria rimanente per creare una finestra nel guscio.
nota: Se il sangue o la membrana sono presenti sul guscio rimosso, l'ovulo non è adatto per l'impianto. Se un'alta percentuale di uova non viene aperta in modo netto, considera di aspettare almeno 1 giorno in più per aprire le uova rimanenti per consentire una migliore formazione di CAM. Se i gusci delle uova rimanenti non sono stati forati, la rotazione delle uova all'interno dell'incubatrice deve essere ripresa.
- Verificare la vitalità dell'embrione. Gli embrioni vitali mostreranno un'ampia vascolarizzazione, albumina chiara, movimento embrionale o un battito cardiaco visibile.
- Usando la pinza Semken, estrarre piccoli pezzi di cotone da un batuffolo di cotone sterile. Tamponare delicatamente la superficie della camma per rimuovere la polvere e i detriti del guscio.
nota: La rimozione dei detriti deve essere eseguita lo stesso giorno in cui le uova vengono aperte.
- Coprire l'apertura del guscio con un quarto di pellicola trasparente di 6 x 7 cm.
- Rimetti le uova nell'incubatrice. Assicurarsi che l'uovo sia posizionato saldamente con la finestra aperta rivolta verso l'alto e che la CAM non tocchi la medicazione in pellicola trasparente. Usa un pezzo di griglia per uova, il bordo del rotatore di uova o un altro oggetto adatto per sostenere le uova che continuano a rotolare.
- Ripetere i passaggi 2.10-2.16 per tutte le uova rimanenti da aprire.
nota: L'apertura degli ovuli non deve essere completata lo stesso giorno dell'impianto. Aspettare almeno 1 giorno può aiutare a eliminare le uova la cui vitalità è stata compromessa aprendo il guscio.