Modellazione del cancro basata sulla membrana corioallantoica del pollo: un modello in ovo per studiare la tumorigenesi e le metastasi delle cellule tumorali

Abstract

Fonte: Sharrow, A. C. et al. Utilizzo del modello in vivo della membrana corioallantoica di pollo per studiare i tumori ginecologici e urologici. J. Vis. Exp.(2020)

In questo video, descriviamo l'impianto di cellule tumorali su una membrana corioallantoidea di pollo per generare un modello in ovo. Il modello innesta con successo le cellule tumorali ovariche per studiare la progressione del cancro ginecologico.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione della sospensione di cellule tumorali per il trapianto (opzione 1)

NOTA: Questo deve essere completato appena prima dell'impianto, che idealmente dovrebbe avvenire tra i giorni 7 e 10. Si prega di consultare le note all'inizio della fase 3 o 4 per ulteriori informazioni sulla data di impianto. Questo approccio è stato utilizzato per tutte le linee cellulari e per i digest tumorali del cancro del rene in coltura.

1. Scongelare la soluzione di matrice extracellulare su ghiaccio.
2. Utilizzando la digestione meccanica e/o enzimatica, ottenere una sospensione di una singola cellula utilizzando un metodo appropriato per il tipo di cellula da impiantare.
3. Risospendere il numero totale di cellule da impiantare in un mezzo appropriato per l'impianto. Gli impianti di 1-2 x 10⁶ cellule per uovo sono tipici.
   nota: Il terreno utilizzato per l'impianto delle linee cellulari è in genere il terreno completo utilizzato per la coltura delle cellule, contenente FBS o siero sostitutivo. L'impianto di digestati tumorali utilizza tipicamente il terreno completo utilizzato per la coltura di linee cellulari dello stesso tipo di cancro. Tuttavia, se necessario, possono essere apportate modifiche sperimentali alla formulazione del mezzo. Gli effetti sullo sviluppo e sulla crescita del tumore dovrebbero essere determinati empiricamente.
4. Pellettare le celle utilizzando una velocità e un tempo di centrifuga adeguati alle celle utilizzate. Le velocità tipiche sono 250-300 x g e i tempi sono di 5-10 minuti.
5. Rimuovere il surnatante dalle celle pellettate mediante pipettaggio. Risospendere meccanicamente le cellule nel mezzo residuo mediante flicking o pipettaggio. Mettere sul ghiaccio a raffreddare. Misurare il volume delle cellule e del terreno utilizzando una pipetta di dimensioni adeguate.
6. Calcolare i volumi di impianto in modo tale che 1-2 x 10⁶ cellule vengano impiantate in un volume di 20-100 μL per uovo con una concentrazione finale di matrice extracellulare di 2,7-4 mg/mL di proteine. Aggiungere il terreno, tutti i fattori di crescita o additivi desiderati e la soluzione di matrice extracellulare in base a questo calcolo. Tenere in ghiaccio fino al momento dell'impianto.
   nota: Per i calcoli di cui ai punti 1.3 e 1.6, deve essere incorporato un volume supplementare di almeno mezzo ovulo impiantato per garantire un volume adeguato per tutti gli ovuli del gruppo. Per l'impianto delle linee cellulari di cancro ovarico (cioè SKOV3 e ID8), sono state impiantate 10⁶ cellule per ovulo. Per l'impianto della linea cellulare di carcinoma a cellule renali RENCA, cellule in coltura derivate da carcinoma renale umano primario digerito, linee cellulari di cancro alla prostata (ad esempio, CWR, C4-2 e MyC-CaP) e linee cellulari di cancro alla vescica (ad esempio, HT-1376 e T24), sono state impiantate 2 x 10⁶ cellule.

2. Preparazione di pezzi di tumore per l'impianto (opzione 2)

NOTA: Questo deve essere completato appena prima dell'impianto, che idealmente dovrebbe avvenire tra i giorni 7 e 10. Si prega di consultare le note all'inizio della fase 3 o 4 per ulteriori informazioni sulla data di impianto. I tumori primari dell'ovaio e della vescica sono stati impiantati come pezzi di tumore.

1. Scongelare la soluzione di matrice extracellulare su ghiaccio. Diluire a una concentrazione proteica finale di 2,7-4 mg/mL in un terreno appropriato contenente tutti i fattori di crescita o gli additivi desiderati. Mantenere il ghiaccio.
   nota: L'impianto di pezzi tumorali utilizza in genere il terreno completo utilizzato per la coltura di linee cellulari dello stesso tipo di cancro. Tuttavia, se necessario, possono essere apportate modifiche sperimentali alla formulazione del mezzo. Gli effetti sull'attecchimento e sulla crescita del tumore dovrebbero essere determinati empiricamente.
2. Usando un bisturi o delle forbici, asporta i pezzi dal tumore fresco. Le dimensioni ideali vanno da 2 a 5 mm su ciascun lato. Mantenere i tessuti immersi nel terreno fino al momento dell'impianto.

3. Impianto utilizzando un anello antiaderente (opzione 1)

NOTA: Le cellule possono essere impiantate a partire dal giorno di sviluppo 7 se la CAM è completamente sviluppata. L'impianto può avvenire in qualsiasi momento prima della schiusa, il che consente un tempo adeguato per lo sviluppo del tumore e l'esperimento desiderato, ma si noti che le cellule immunitarie dell'embrione iniziano ad essere presenti intorno al decimo giorno dopo la fecondazione. Il tasso di crescita del tumore varia considerevolmente in base al tipo di cellula e deve essere determinato empiricamente per il tipo di cellula di interesse. Le cellule del cancro ovarico e del cancro alla prostata sono state impiantate utilizzando il metodo dell'anello antiaderente. Si noti che quando non è disponibile un anello antiaderente, è possibile tagliare e utilizzare un puntale per pipetta di dimensioni simili.

1. Utilizzare il 70% di etanolo per disinfettare una cabina di biosicurezza e tutti gli strumenti necessari: un portauova, una pinza a iride curva, anelli antiaderenti (diametro interno di 1/4 di pollice), asta di agitazione in vetro, pipette e puntali di volume appropriato, 6 x 7 cm di pellicola trasparente, forbici da ufficio e pennarello o matita. Quando possibile, devono essere utilizzati strumenti sterili, monouso o autoclavati.
2. Posizionare gli ovuli da impiantare su un portauova in un armadio di biosicurezza. Seleziona un numero gestibile di uova. Fino a sei è tipico. Evita di lasciare che le uova si raffreddino notevolmente mentre le lavori.
3. Rimuovere la pellicola trasparente dal guscio arrotolando i bordi verso la finestra aperta per evitare di staccare pezzi di guscio. Controlla che le uova siano vitali e sane. Le uova ideali avranno un grande vaso al centro dell'area aperta con vasi più piccoli che si diramano da esso.
4. Utilizzando una pinza a iride curva, posizionare un anello sterile e antiaderente sulla camma sopra il recipiente, idealmente su un punto di diramazione. Utilizzare un'asta di agitazione in vetro sterile per abradere delicatamente la CAM.
5. Pipet la sospensione della cella dal passaggio 1.6 al centro dell'anello antiaderente. In alternativa, utilizzare una pinza per posizionare un pezzo di tumore dal passaggio 2.2 al centro dell'anello antiaderente e coprire con 20-50 μl della soluzione di matrice extracellulare generata nel passaggio 2.1.
6. Sigillare l'apertura con un quarto di pellicola trasparente di 6 x 7 cm. Etichettare gli ovuli con una designazione di impianto appropriata.
   nota: La numerazione delle uova all'interno di un gruppo facilita le osservazioni longitudinali.
7. Rimetti l'uovo nell'incubatrice. Assicurati che l'apertura del guscio sia in posizione verticale e che l'uovo sia ben saldo.
   nota: Le uova possono essere rimesse in un'incubatrice senza rotazione. In alternativa, un'elevata vitalità post-impianto può essere ottenuta utilizzando un incubatore cellulare a 37-38 °C con la CO₂ disattivata e un igrometro per monitorare l'umidità, che dovrebbe essere del 50%-80%.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
010 Teflon (PTFE) Bianco 55 Duro Shore D O-Ring	Il negozio O-Ring	TEF010	Anello antiaderente per la semina cellulare. 1/4 "ID X 3/8" OD X 1/16 "CS Politetrafluoroetilene (PTFE).
forbici da lavoro delicate; Curvo; Acuto-tagliente; Lunghezza lama 30 mm; 4-3/4 pollici Lunghezza	Roboz Chirurgico	RS6703	Questo è fornito come esempio. Anche qualsiasi forbice curva simile funzionerebbe.
Kit di utensili Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max	Dremel	8050-N/18	Questo kit contiene tutti gli strumenti necessari
Uova di gallina fecondate (Rhode Island Red - Brown, Lab Grade)	Uova da laboratorio AA Inc.	N/A	Sarebbe necessario identificare un fornitore locale di uova, poiché questo fornitore consegna solo a livello regionale.
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Kit combinato incubatrice per uova	Magazzino Incubatore	HB1588D-NONE-1102-1588-1357	Possono essere utilizzate altre incubatrici per uova, ma la loro affidabilità dovrebbe essere verificata. Dopo l'impianto, può essere utilizzato anche un incubatore cellulare con CO2 disabilitata.
Incu-Bright Candelabro per uova a luce fredda	Magazzino Incubatore	Codice: 1102	Possono essere utilizzati altri candelabri, ma questo è preferito tra quelli che abbiamo testato. Questo candelabro è incluso nel suddetto kit incubatrice.
Matrice di membrana Matrigel HC; Senza LDEV	Corning	354248	Soluzione di matrice extracellulare
SKOV3	ATCC	HTB-77	Linea cellulare di carcinoma ovarico umano.
Aste di agitazione con poliziotto di gomma; diametro 5mm, lunghezza 6 pollici	Forniture scientifiche unite	GRPL06	Questo è fornito come esempio. Funzionerebbero anche aste di agitazione in vetro simili.
Pinze per campioni	Scienze della microscopia elettronica	Codice: 72914	Questo è fornito come esempio. Le pinze utilizzate per estrarre il guscio per l'imaging a bioluminescenza sono lunghe circa 12,8 cm con punte larghe 3 mm.