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1. Trattamento con bisolfito
- Utilizzare 45 μl della soluzione di tessuto digerito come campione.
- Eseguire il trattamento con bisolfito utilizzando i reagenti in un kit di conversione del bisolfito secondo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).
- Aggiungere 5 μl di tampone di diluizione al campione di DNA e incubare a 37 °C per 15 minuti (vedere la tabella dei materiali).
- Durante l'incubazione dei campioni, preparare il reagente di conversione del bisolfito aggiungendo 750 μL di dH2O e 210 μL di tampone di diluizione a una provetta di reagente di conversione CT (vedere la Tabella dei materiali). Mescolare i tubi a vortice per 10 minuti.
- Dopo 15 minuti di incubazione, aggiungere 100 μl del reagente di conversione CT preparato a ciascun campione e mescolare per inversione.
- Incubare i campioni al buio a 50 °C per 12-16 ore.
- Dopo l'incubazione, rimuovere i campioni e metterli in ghiaccio per 10 minuti.
- Aggiungere 400 μl di tampone legante e miscelare ogni campione mediante pipettaggio verso l'alto e verso il basso (vedere la Tabella dei materiali). Caricare ciascun campione in una colonna rotante e posizionare la colonna in una provetta di raccolta da 2 mL (vedere la Tabella dei materiali).
- Centrifugare ogni campione alla massima velocità (10.000 x g) per 1 minuto ed eliminare il flusso.
- Aggiungere 200 μl di tampone di lavaggio a ciascuna colonna e centrifugare alla massima velocità per 1 minuto, scartando il flusso (vedere la tabella dei materiali).
- Aggiungere 200 μl di tampone di desolfonazione a ciascuna colonna e lasciare riposare la colonna a temperatura ambiente per 15 minuti (vedere la tabella dei materiali). Dopo l'incubazione, centrifugare le colonne alla massima velocità per 1 minuto e scartare il flusso.
- Aggiungere 200 μl di tampone di lavaggio a ciascuna colonna e centrifugare alla massima velocità per 1 minuto (vedere la tabella dei materiali).
- Ripetere questo passaggio ancora una volta.
- Aggiungere 46 μL di dH2O a ciascuna colonna e posizionare ciascuna colonna in una nuova provetta sterile in polipropilene monouso da 1,5 mL (vedere la Tabella dei materiali). Centrifugare ogni provetta per 2 minuti per eluire il DNA.
- Rimuovere ogni colonna di centrifuga dal tubo in polipropilene monouso e gettarla (vedere la tabella dei materiali). Il DNA è ora pronto per l'analisi.
2. PCR quantitativa specifica per la metilazione (qMSP)
- Utilizzare il DNA modificato con bisolfito del passaggio 1.3 come modello per la PCR in tempo reale basata sulla fluorescenza in qMSP per valutare la metilazione della regione del promotore in ciascuna analisi genica.
- Eseguire qMSP utilizzando uno strumento di PCR in tempo reale a 96 pozzetti (vedere la Tabella dei materiali).
- Verificare lo stato di metilazione del promotore del gene bersaglio sul DNA modificato con bisolfito utilizzando sonde da 200 nM in avanti, 200 nM in reverse primer e 80 nM. Preparare la miscela master con 16,6 mM (NH4)2SO4, 67 mM Tris pH 8,8, 10 mM β-mercaptoetanolo, 10 nM di fluoresceina, 0,166 mM di ciascun deossinucleotide trifosfato e 0,04 U/μl di DNA polimerasi (vedere Tabella dei materiali). Il volume di reazione finale in ciascun pozzetto per tutti i saggi è di 25 μl.
- Eseguire il ciclo di qMSP come segue: 95 °C per 5 minuti, seguiti da 55 cicli di 95 °C per 15 s, 60 °C per 1 minuto e 72 °C per 1 min.
NOTA: Il gene bersaglio deve essere scelto in base ai criteri di avere valori beta più grandi, essere correlato alle isole CpG nella regione del promotore e essere adatto per la progettazione di primer e sonde per qMSP.
- Utilizzare la genomica umana trattata con CpG Metilasi (M.SssI) come controllo positivo della metilazione (vedi Tabella dei materiali).
nota: La quantificazione finale della metilazione è definita come il valore di metilazione relativa (RMV) e calcolata come 2-ΔΔCt per ogni replica di rilevamento della metilazione rispetto al Ct medio per la β-actina (ACTB). Le sequenze di primer e sonda sono mostrate nella Tabella 1. Un Ct di 100 viene utilizzato per le repliche non rilevate, che fornisce un valore di 2–ΔΔCt vicino a zero. Viene utilizzata la seguente formula:
media 2–ΔΔCt (RMV) = (2–ΔΔ Ct_replicate_1 + 2–ΔΔ Ct_replicate_2 + 2–ΔΔ Ct_replicate_3)/3.
| gene | Avanti 5' - 3' | Inverso 5' - 3' | sonda |
| B-ACTINA | TAG: GGA, GTA, TAT, AGG, TTG, GGG, AAG, TT | AAC ACA CAA TAA CAA ACA CAA ATT CAC | \56-FAM\ TGT GGG GTG \ZEN\ GTG ATG GAG GAG GAG GTT TAG \3IABkFQ\ |
| EPB41L3 | GGG ATA GTG GGG TTG ACG C | ATA AAA ATC CCG ACG AAC GA | AAA TTC GAA AAA CCG CGC GAC GCC GAA ACC A |