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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Crioconservazione dei tessuti
NOTA: Questa parte fa riferimento principalmente ai metodi per il kit Cryo Kit Live Tissue. I kit e le attrezzature principali sono elencati nella Tabella dei Materiali.
- Sopprimere i topi con un metodo approvato dall'IRB quando il tumore ha un diametro superiore a 10 mm.
- Usando pinze e forbici sterili, isola lentamente il tumore dai topi.
- Lavare i tessuti tumorali con DPBS in un piatto da 10 cm. Sezionare e rimuovere le aree necrotiche, il tessuto adiposo, i coaguli di sangue e il tessuto connettivo con pinze e forbici.
- Tagliare i tessuti tumorali ad uno spessore massimo di 1 mm con uno stampo.
- Lavare le fette con DPBS in una pirofila da 10 cm.
nota: Il processo di vetrificazione prevede l'uso di provette marcate V1/V2/V3 nelle fasi 1.6-1.8. Gli ingredienti principali sono DMSO e saccarosio.
- Trasferire le fette nella provetta V1 con una pinza e incubare la provetta a 4 °C per 4 minuti. Arrotolare e capovolgere brevemente la provetta e posizionarla a 4 °C per altri 4 minuti.
- Versare la soluzione V1 e le fette in un piatto da 10 cm. Trasferire le fette nella provetta V2 con una pinza e incubare la provetta V2 a 4 °C per 4 minuti. Arrotolare e capovolgere brevemente il tubo e posizionarlo a 4 °C per altri 4 minuti.
- Versare la soluzione V2 e le fette in un piatto da 10 cm. Trasferire le fette nella provetta V3 con una pinza e incubare la provetta a 4 °C per 5 minuti. Arrotolare e capovolgere brevemente il tubo e posizionarlo a 4 °C per almeno 5 minuti. Assicurati che le fette affondino tutte sul fondo del tubo.
- Se più fette rimangono galleggianti, arrotolare e capovolgere brevemente la provetta e riposizionare la provetta a 4 °C fino a quando tutte le fette non affondano completamente; se necessario, scartare le fette galleggianti.
- Versare la soluzione V3 e le fette in un piatto da 10 cm.
- Tagliare i portafazzoletti alla lunghezza corretta e posizionarli su una garza sterile. Trasferire le fette sui supporti. Avvolgere i supporti con la garza e metterli in azoto liquido usando una pinza, seguita da incubazione per 5 minuti.
- Etichettare le fiale criogeniche con le informazioni sul tessuto.
- Trasferire i supporti con fette di tessuto in fiale criogeniche, che vengono conservate in azoto liquido.