Isolamento peritoneale dei neutrofili a bassa densità: una tecnica per ottenere neutrofili a bassa densità dal liquido di lavaggio peritoneale utilizzando la selezione cellulare attivata magneticamente

In questo articolo

Abstract

Fonte: Kanamaru, R. et al. Le trappole extracellulari dei neutrofili generate da neutrofili a bassa densità ottenuti dal liquido di lavaggio peritoneale mediano la crescita e l'attaccamento delle cellule tumorali. J. Vis. Exp. (2018)

In questo video, descriviamo la procedura per isolare i neutrofili a bassa densità, o LDN, dal liquido di lavaggio peritoneale di un paziente umano postoperatorio. Le LDN così ottenute possono essere utilizzate in ulteriori esperimenti a valle per comprendere il loro ruolo nella crescita e nella progressione tumorale.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.

1. Isolamento di LDN dai lavaggi della cavità addominale

Acquisizione del campione
1. Infondere 1.000 ml di soluzione fisiologica sterile normale direttamente nella cavità addominale prima della chiusura della ferita nei pazienti che hanno subito un intervento chirurgico addominale a causa di neoplasie gastrointestinali.
  nota: I campioni sono stati ottenuti da pazienti sottoposti a gastrectomia, colectomia o esofagectomia senza pregiudizi basati sull'età o sul sesso. La soluzione salina è stata trasferita in un contenitore e versata in tutto l'addome entro un minuto. Questo viene eseguito di routine come lavaggio peritoneale postoperatorio senza effetti significativi sui pazienti.
2. Lavare abbondantemente la cavità addominale per almeno 1 min.
  nota: Si raccomanda di mescolare lentamente il fluido infuso con le mani del chirurgo in modo che i campioni siano uniformi.
3. Recuperare 200 mL di liquido di lavaggio con quattro siringhe da 50 mL.
  nota: A volte, viene utilizzato un connettore in gomma per assorbire i fluidi.
Eseguire la purificazione delle LDN peritoneali utilizzando mAb specifici per granulociti, CD66b
nota: Poiché lo strato intermedio dopo la centrifugazione in gradiente di densità contiene molte cellule mononucleate, è stata eseguita una selezione positiva di neutrofili polimorfi utilizzando mAb CD66b.
1. Trasferire il liquido di lavaggio peritoneale in una provetta da 50 mL.
  nota: In questa fase, far passare i fluidi attraverso un filtro in nylon da 100 μm per rimuovere le impurità.
2. Centrifugare il liquido peritoneale a 270 x g per 7 minuti a RT.
3. Risospendere i pellet in 5 mL di PBS con EDTA allo 0,02%.
4. Sovrapporre con cura i 5 mL di sospensione cellulare su una soluzione a gradiente di densità da 3 mL.
5. Centrifugare a 1.700 x g per 15 minuti a RT senza interruzioni.
6. Prelevare circa 2-3 mL di una soluzione contenente gli strati intermedi (Figura 1A) utilizzando una pipetta e mescolarla con 10 mL di PBS con EDTA allo 0,02%.
7. Centrifugare il liquido peritoneale a 400 x g per 7 minuti a RT ed eliminare il surnatante.
8. Aggiungere altri 10 mL di PBS con EDTA allo 0,02% e centrifugare a 270 x g per 7 minuti a RT. Scartare il surnatante.
9. Sciogliere il pellet di cella (1 x 10⁷) in 60 μL di tampone per il kit di separazione magnetica delle celle.
10. Aggiungere 20 μl di blocco Fc ai pellet e incubare per 10 minuti a 4 °C.
11. Aggiungere 20 μl di anti-CD66b coniugato con microsfere e incubare per altri 10 minuti a 4 °C.
12. Lavare e risospendere i pellet in 500 μL di tampone MACS.
13. Applicare la sospensione cellulare su una colonna magnetica nel campo magnetico di un separatore magnetico adatto e raccogliere le celle CD66b(-) contenenti il flusso continuo lavando la colonna con 15 mL di tampone.
14. Rimuovere la colonna dal separatore magnetico e sciacquare immediatamente le celle CD66b(+) marcate magneticamente spingendo con decisione lo stantuffo nella colonna.
  nota: La popolazione cellulare CD66b(+) è costituita principalmente da neutrofili, come determinato dall'analisi FACS, indicando che il >95% della frazione CD66(+) è positivo per CD11b, CD15 e CD16, ma negativo per CD14.

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Risultati

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Figura 1: Formazione di NET dopo la coltura di LDN peritoneale. (A)Dopo la centrifugazione in gradiente di densità del liquido di lavaggio postoperatorio, vengono mostrate le cellule recuperate dallo strato intermedio. (B) Quindi, le LDN CD66b(+) sono state separate dalle cellule mononucleate CD66b(-) e coltivate su piastre a 6 pozzetti rivestite di poli-L-lisina, seg...