Microscopia a fluorescenza di trappole extracellulari neutrofile o NET: una tecnica per osservare l'interazione adesiva tra cellule tumorali e NET

Abstract

Fonte: Kanamaru, R. et al. Le trappole extracellulari dei neutrofili generate da neutrofili a bassa densità ottenuti dal liquido di lavaggio peritoneale mediano la crescita e l'attaccamento delle cellule tumorali. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video dimostra la colorazione fluorescente delle trappole extracellulari dei neutrofili (NET), i componenti del DNA extracellulare espulsi dai neutrofili. Questa tecnica consente la visualizzazione dell'interazione adesiva tra cellule tumorali e NET.

Protocollo

1. Colorazione delle cellule tumorali con colorante linker cellulare fluorescente rosso

1. Preparare le linee cellulari tumorali umane MKN45, NUGC e OCUM-1.
2. Lavare 1 x 10⁷ celle con PBS + 0,02% EDTA in una provetta da 15 mL e centrifugare a 270 x g per 7 minuti a RT.
3. Aggiungere 1 mL di soluzione per la colorazione del colorante ai pellet e pipettare delicatamente.
4. Sciogliere 4 μL di colorante Red Fluorescent Cell Linker in 1 mL di soluzione per la colorazione e miscelare con la sospensione cellulare dal passaggio 1.2.
5. Incubare i pellet per 4 minuti a RT.
6. Ag....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione di colorante per acido nucleico verde SYTOX 5 mM in DMSO	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Stati Uniti	S7020
PKH26 Kit di collegamento cellulare fluorescente rosso per l'etichettatura generale della membrana cellulare	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Stati Uniti	P9691
RPMI1640 Medio	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Stati Uniti	Codice: R8758
Siero Bovino Albumina liofilizzata in polvere, ≥96% (elettroforesi su gel di agarosio)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Stati Uniti	Codice A2153
MICROPIASTRA 6Well rivestita in poli-L-lisina	IWAKI, Giappone	Codice 4810-040
Stereomicroscopio con fluoresceina	BX8000, Keyence, Osaka, Giappone	BZ-X710
Linea cellulare di cancro gastrico umano MKN45	Riken, Tukuba Giappone	N/A
Linea cellulare di carcinoma gastrico umano NUGC-4	Riken, Tukuba Giappone	N/A
Linea cellulare di carcinoma gastrico umano OCUM-1	Università della città di Osaka, Giappone	N/A	Dono del Dr. M. Yashiro
DNasi I	Worthington, Lakewood NJ	LS002138
Soluzione 0,5 mol/l-EDTA (pH 8,0)	Nacalai tesque, Giappone	Codice 06894-14
Dulbecco's Modified Eagle Glucosio medio-alto (DMEM)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Stati Uniti	D5796