Microscopia a fluorescenza di trappole extracellulari neutrofile o NET: una tecnica per osservare l'interazione adesiva tra cellule tumorali e NET

Abstract

Fonte: Kanamaru, R. et al. Le trappole extracellulari dei neutrofili generate da neutrofili a bassa densità ottenuti dal liquido di lavaggio peritoneale mediano la crescita e l'attaccamento delle cellule tumorali. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video dimostra la colorazione fluorescente delle trappole extracellulari dei neutrofili (NET), i componenti del DNA extracellulare espulsi dai neutrofili. Questa tecnica consente la visualizzazione dell'interazione adesiva tra cellule tumorali e NET.

Protocollo

1. Colorazione delle cellule tumorali con colorante linker cellulare fluorescente rosso

1. Preparare le linee cellulari tumorali umane MKN45, NUGC e OCUM-1.
2. Lavare 1 x 10⁷ celle con PBS + 0,02% EDTA in una provetta da 15 mL e centrifugare a 270 x g per 7 minuti a RT.
3. Aggiungere 1 mL di soluzione per la colorazione del colorante ai pellet e pipettare delicatamente.
4. Sciogliere 4 μL di colorante Red Fluorescent Cell Linker in 1 mL di soluzione per la colorazione e miscelare con la sospensione cellulare dal passaggio 1.2.
5. Incubare i pellet per 4 minuti a RT.
6. Aggiungere 4 mL di DMEM (10% FBS) per fermare la reazione di colorazione.
7. Centrifugare 270 x g per 7 minuti ed eliminare il surnatante.
8. Ripetere i passaggi 1.6 e 1.7 due volte.
9. Verificare con un microscopio a fluorescenza (eccitazione = 551 nm, emissione = 567 nm) che le cellule tumorali siano colorate di rosso.

2. Analisi dell'adesione delle cellule tumorali ai NET

1. Coltura di cellule neutrofile a bassa densità in una piastra rivestita di poli-L-lisina a 6 pozzetti (6 cm di diametro) per 2 ore a 37 °C in CO₂ al 5%, che consente la produzione di trappole extracellulari per neutrofili o NET
2. Trasferire le cellule tumorali rosse colorate con fluorescenza (1 x 10⁶) in 1 mL di RPMI 1640 integrato con BSA allo 0,1%.
3. Aggiungere le cellule tumorali alla coltura LDN che ha prodotto i NET.
4. Incubare per 5 minuti a 37 °C, il che consente alle cellule tumorali di entrare in contatto con i NET.
   nota: Una lunga incubazione induce l'adesione delle cellule tumorali all'LDN o alle piastre.
5. Rimuovere il terreno e lavare delicatamente i pozzetti aggiungendo 2 ml di terreno preriscaldato (0,1% BSA + RPMI 1640) e agitando il piatto.
6. Ripetere la procedura di lavaggio al punto 2.5 due volte.
   nota: Poiché i NET si attaccano debolmente alla piastra, il lavaggio deve essere eseguito il più delicatamente possibile per evitare la rimozione dei NET stessi.
7. Aggiungere un colorante fluorescente verde per colorare il nucleo e i cromosomi a una concentrazione finale di 5 μg/mL per la visualizzazione dei NET.
8. Osservare i NET e le cellule tumorali attaccate utilizzando gli appositi filtri (verde, eccitazione = 504 nm, emissione = 523 nm; rosso, eccitazione = 551 nm, emissione = 567 nm).
9. Unisci le figure per mostrare le cellule tumorali intrappolate dai NETs.
   nota: In alcuni esperimenti, l'enzima di degradazione del DNA è stato aggiunto alla coltura LDN (concentrazione finale di 100 U/mL) 5 minuti prima della co-incubazione per 5 minuti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione di colorante per acido nucleico verde SYTOX 5 mM in DMSO	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Stati Uniti	S7020
PKH26 Kit di collegamento cellulare fluorescente rosso per l'etichettatura generale della membrana cellulare	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Stati Uniti	P9691
RPMI1640 Medio	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Stati Uniti	Codice: R8758
Siero Bovino Albumina liofilizzata in polvere, ≥96% (elettroforesi su gel di agarosio)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Stati Uniti	Codice A2153
MICROPIASTRA 6Well rivestita in poli-L-lisina	IWAKI, Giappone	Codice 4810-040
Stereomicroscopio con fluoresceina	BX8000, Keyence, Osaka, Giappone	BZ-X710
Linea cellulare di cancro gastrico umano MKN45	Riken, Tukuba Giappone	N/A
Linea cellulare di carcinoma gastrico umano NUGC-4	Riken, Tukuba Giappone	N/A
Linea cellulare di carcinoma gastrico umano OCUM-1	Università della città di Osaka, Giappone	N/A	Dono del Dr. M. Yashiro
DNasi I	Worthington, Lakewood NJ	LS002138
Soluzione 0,5 mol/l-EDTA (pH 8,0)	Nacalai tesque, Giappone	Codice 06894-14
Dulbecco's Modified Eagle Glucosio medio-alto (DMEM)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Stati Uniti	D5796