Microscopia a fluorescenza time-lapse di trappole extracellulari neutrofile o NET: una tecnica per analizzare l'interazione post-adesione tra cellule tumorali e NET

Abstract

Fonte: Kanamaru, R. et al. Le trappole extracellulari dei neutrofili generate da neutrofili a bassa densità ottenuti dal liquido di lavaggio peritoneale mediano la crescita e l'attaccamento delle cellule tumorali. J. Vis. Exp. (2018)

In questo video, analizziamo il comportamento post-adesione delle cellule tumorali intrappolate in trappole extracellulari di neutrofili (NET) mediante la co-coltura di neutrofili a bassa densità e cellule tumorali gastriche. L'analisi video time-lapse aiuta a monitorare vari eventi cellulari e a studiare il ruolo dei NET in condizioni patologiche.

Protocollo

1. Analisi video Time Lapse delle cellule tumorali intrappolate

1. Coltivare le LDN peritoneali in una piastra rotonda da 35 mm rivestita di poli-L-lisina e incubare per 2 ore a 37 °C in CO₂ al 5%.
2. Aggiungere il colorante fluorescente verde per colorare il nucleo e i cromosomi per visualizzare i NET alla concentrazione finale di 5 μM.
3. Dopo 1 minuto di incubazione, rimuovere il terreno e aggiungere 2 mL di BSA allo 0,1% + RPMI 1640.
4. Rimuovere il supporto e aggiungere 1 x 10⁶ celle MKN45 non colorate sospese allo 0,1% BSA + RPMI 1640. Incubare per 5 minuti a RT.
5. Rimuovere eventuali cellule tumorali non attaccate lavando delicatamente il piatto aggiungendo 2 ml di terreno preriscaldato (0,1% BSA + RPMI 1640) e agitando il piatto.
6. Ripetere due volte la procedura di lavaggio di cui sopra.
   nota: Poiché i NET si attaccano debolmente alla piastra, il lavaggio deve essere eseguito il più delicatamente possibile per evitare la rimozione dei NET stessi.
7. Aggiungere DMEM con FCS al 10% integrato con 100 u/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina.
8. Monta la piastra di coltura in un sistema di osservazione cellulare a vista intera e seleziona il campo appropriato in cui le cellule tumorali vengono intrappolate dai NET.
9. Continuare la co-coltura per altri due giorni e scattare foto continue del campo ogni 6 minuti in condizioni di luce normale e fluorescenza, che rilevano rispettivamente le cellule MKN45 e i NET.
10. Sovrapponi le immagini in ogni momento e costruisci video time-lapse utilizzando il software Image Viewer.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione 5mM di colorante per acido nucleico verde SYTOX in DMSO	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Stati Uniti	S7020
RPMI1640 Medio	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Stati Uniti	Codice: R8758
Dulbecco's Modified Eagle Glucosio medio-alto (DMEM)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Stati Uniti	D5796
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Stati Uniti	D8537
Siero fetale bovino, regioni qualificate e approvate dall'USDA	gibco di life technologies, Messico	Codice 10437-028
Siero Bovino Albumina liofilizzata in polvere, ≥96% (elettroforesi su gel di agarosio)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Stati Uniti	Codice A2153
Penicillina Streptomicina	Tecnologie per la vita Giappone	Codice: 15140-122
Plasmocin profilattico	InvivoGen, San Diego, CA-USA	ANT-MPP
Stereomicroscopio con fluoresceina	BX8000, Keyence, Osaka, Giappone	BZ-X710
Sistema di osservazione delle celle a vista intera	Nikon, Kanagawa, Giappone	BioStudio (BS-M10)
Linea cellulare di cancro gastrico umano MKN45	Riken, Tukuba Giappone	N/A