Preparazione del blocco di esosomi: un protocollo per preservare gli esosomi da cellule di cancro del colon umano in coltura

Abstract

Fonte: Jung, M. K. et al. Preparazione del campione e imaging di esosomi mediante microscopia elettronica a trasmissione. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video descrive la tecnica di preparazione di blocchi di esosomi da cellule tumorali gastrointestinali in coltura. Questi blocchi di esosomi possono essere ulteriormente affettati, colorati e visualizzati per determinare la posizione di proteine specifiche nella vescicola a doppio strato lipidico.

Protocollo

1. Preparazione a blocchi degli esosomi

1. Pellettare gli esosomi dal surnatante di coltura di cellule HCT116 mediante centrifugazione a 100.000 x g per 1,5 ore. Rimuovere il surnatante di coltura e fissare con cura il pellet di esosoma purificato con 1 mL di glutaraldeide al 2,5% in una soluzione di cacodilato di sodio 0,1 M (pH 7,0) per 1 ora a 4 °C. Per cacodilato di sodio 0,1 M, sciogliere 4,28 g di acido cacodilico in 160 ml di acqua distillata (DW). Regolare il pH a 7,4 con 0,1 M HCl, quindi portare fino a 200 mL con acqua distillata.
2. Rimuovere il fissativo e sciacquare i pellet con 1 mL di tampone di cacodilato di sodio 0,1 M a temperatura ambiente. Ripetere tre volte, con ogni cambio della durata di 10 minuti.
3. Post-fissare il campione con 1 mL di tetrossido di osmio al 2% per 1 ora a 4 °C.
4. Rimuovere il fissativo e risciacquare tre volte con tampone di cacodilato di sodio 0,1 M ogni 10 minuti.
5. Incubare per 10 minuti con una serie di acetoni graduati (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, rispettivamente) sull'agitatore.
6. Rimuovere l'acetone e incubare la soluzione di acetone:miscela di inclusione a bassa viscosità 3:1 per 30 minuti. Il pellet dell'esosoma si trova nel tubo.
7. Rimuovere il terreno e aggiungere 1:1 acetone: miscela di incorporamento a bassa viscosità, quindi incubare per 30 minuti.
8. Rimuovere il terreno e aggiungere 1:3 acetone: miscela di inclusione a bassa viscosità, quindi incubare per 30 minuti.
9. Rimuovere il terreno e aggiungere una miscela di inclusione a bassa viscosità al 100% e incubare per una notte a temperatura ambiente.
10. Incorporare il campione in una miscela di inclusione pura a bassa viscosità utilizzando lo stampo di inclusione e cuocere per 24 ore a 65 °C.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Glutaraldeide	Ems	Codice: 16200
Cacodilato di sodio	Ems	Codice: 12300
Tetrossido di osmio 1 g cristallo	Ems	Anno 19100	Utilizzare solo in cappa aspirante
acetone	JUNSEI	1B2031