Sezionamento, colorazione e imaging TEM di esosomi incorporati: un protocollo per visualizzare le caratteristiche strutturali degli esosomi utilizzando TEM

Abstract

Fonte: Jung, M. K. et al. Preparazione del campione e imaging di esosomi mediante microscopia elettronica a trasmissione. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video descrive la tecnica per preparare una sezione sottile di esosomi incorporati. Queste sezioni possono essere ulteriormente colorate e visualizzate utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione, o TEM, per studiare le caratteristiche strutturali degli esosomi.

Protocollo

1. Sezionamento degli esosomi

1. Preparare il blocco di esosoma incorporando il campione di esosoma purificato (ottenuto dal surnatante di coltura di cellule HCT116) in una miscela di inclusione pura a bassa viscosità.
2. Sezionare il blocco dell'esosoma con uno spessore di 60 nm attraverso un ultra-microtomo.
3. Doppio colorante con acetato di uranile al 2% per 20 min e citrato di piombo per 10 min.
   Per la soluzione di piombo Reynolds, aggiungere 1,33 g di nitrato di piombo e 1,76 g di citrato di sodio per un totale di 50 ml di acqua distillata.
4. Osservare la rete al microscopio elettronico a trasmissione a 80 kV.
5. Fare clic su "Acquisisci", quindi su "File" e "Salva con nome" nel sistema di telecamere CCD al microscopio elettronico a 80 kV. Seguire le impostazioni automatiche per il tempo di esposizione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ultra-microtomo	Leica	UCT
Acetato di uranile	Ems	Codice 22400	Sostanze chimiche pericolose
Citrato di piombo	Ems	Telefono 17900
Microscopia elettronica a trasmissione	Hitachi	H7600
Griglia in nichel	Ems	G200-NI
Griglia in rame	Ems	G200-Cu
Microscopia elettronica a trasmissione	JEOL	JEM2200FS