Immunocolorazione con oro delle sezioni esosomiali: una tecnica per visualizzare i marcatori diagnostici nel lume esosomiale

Abstract

Fonte: Jung, M. K., Mun, J. Y. Preparazione del campione e imaging di esosomi mediante microscopia elettronica a trasmissione. J. Vis. Exp. (2018)

In questo video, dimostriamo l'immunocolorazione con oro di biomarcatori localizzati all'interno della regione del lume di sezioni esosomiali ultrasottili. Questa tecnica consente la diagnosi precoce delle malattie mediante la visualizzazione delle molecole bersaglio all'interno degli esosomi secreti dalle cellule malate.

Protocollo

1. Immunocolorazione di sezioni di esosomi e imaging

1. Preparare sezioni ultrasottili da 60 nm di un blocco di esosomi utilizzando un ultra-microtomo e raccoglierle su una griglia di nichel.
2. Incubare le griglie in gocce da 50 μL di glicina 0,02 M per 10 minuti per estinguere i gruppi aldeidici liberi.
3. Sciacquare in 100 μL di DW tre volte ciascuna per 10 minuti. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora in PBS contenente l'1% di BSA.
4. Incubare le griglie in 50-100 μL di gocce di anticorpo anti-KRS (1:100 in PBS contenente lo 0,1% di BSA) per 1 ora (se necessario, questa fase deve essere eseguita a 4 °C durante la notte).
5. Lavare le griglie con cinque gocce separate (50 μL) di PBS contenenti lo 0,1% di BSA per 10 minuti ciascuna.
6. Trasferire le griglie in gocce di anticorpo secondario per 1 ora (IgG anti-coniglio coniugata a una particella d'oro di 10 nm (1:100) in PBS contenente lo 0,1% di BSA).
7. Lavare le griglie con cinque gocce separate (50 μL) di PBS contenenti lo 0,1% di BSA ogni 10 minuti.
8. Doppia colorazione con acetato di uranile al 2% per 20 minuti in condizioni di oscurità e con citrato di piombo di Reynold per 10 minuti, rispettivamente.
9. Osservare le griglie al microscopio elettronico a trasmissione a 80 kV.
10. Fare clic su "Acquisisci", quindi su "File" e "Salva con nome" nel sistema di telecamere CCD sotto il TEM a 80 kV. Il tempo di esposizione ha seguito le impostazioni automatiche.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acetato di uranile	Ems	Codice 22400	Sostanze chimiche pericolose
Citrato di piombo	Ems	Telefono 17900
Microscopia elettronica a trasmissione	Hitachi	H7600
Griglia in rame	Ems	G200-Cu
glicina	sigma	Codice 022K5404
Soluzione salina tampone fosfato	sigma	P4417
Albumina sierica bovina	Aurion	Codice 25557
Anticorpo anti-umano purificato CD274 (B7-H1, PD-L1)	BioLeggenda	Codice 329710	Montatura intera Immumogold
IgG2b di topo purificato, κ Isotipo Ctrl	BioLeggenda	401202	Montatura intera Immumogold (Controllo)
2a particella d'oro coniugata 9-11 nm IgG anti-topo	sigma	G7652
Paraformaldeide	Ems	Anno 19210