Articolo metodologico

Colorazione negativa di esosomi purificati: una procedura per visualizzare la morfologia degli esosomi utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione

30 aprile 2023

In questo articolo

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fonte: Jung, M. K. et al. Preparazione del campione e imaging di esosomi mediante microscopia elettronica a trasmissione. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video descrive una procedura per la colorazione negativa di esosomi purificati. Gli esosomi colorati negativamente vengono riprodotti utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione. Questa tecnica aiuta a visualizzare la morfologia degli esosomi.

Protocollo

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1. Colorazione negativa

  1. Scaricare a bagliore le sottili griglie EM in rame da 200 mesh rivestite con film di carbonio per 1 minuto mediante scaricatore a incandescenza.
  2. Fissare gli esosomi purificati con 1 mL di paraformaldeide (PFA) al 2% per 5 min.
    NOTA: I fumi di paraformaldeide sono tossici. Tutto il lavoro deve essere svolto in una cappa aspirante ventilata.
  3. Caricare 5-7 μL di soluzione di sospensione esosomica sulla griglia e incubare per 1 min. Se la concentrazione di esosoma è troppo alta, diluire la concentrazione da metà a un quinto.
  4. Colorare immediatamente con la siringa con ~20 gocce di soluzione filtrata di acetato di uranile (UA) all'1% sulla superficie della griglia EM
    5. .
  5. Rimuovere la soluzione di UA in eccesso sulla griglia a contatto con il bordo della griglia con carta da filtro.
  6. Sciacquare rapidamente la griglia con una goccia d'acqua. Questo passaggio rimuoverà la soluzione colorante in eccesso.
  7. Posiziona la griglia sul tavolo tenendola con una pinzetta e copri parzialmente la griglia con un piatto di coltura per asciugare per 10 minuti a temperatura ambiente.
  8. Conservare la rete in una scatola di rete EM per l'osservazione futura da parte di un TEM a 80 kV.

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Dichiarazioni

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Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Acetato di uranileEmsCodice 22400Sostanze chimiche pericolose
Microscopia elettronica a trasmissioneJEOLJEM2200FS
Scaricatore di baglioreJEOLJFC1100E
ParaformaldeideEmsAnno 19210
Formvar rivestito in carbonio Rame
Griglia (200 mesh)		EmsFCF200-CU
Formvar rivestito in carbonio Nichel
Griglia (200 mesh)		EmsFCF200-NI

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Tag

Purificazione degli esosomicolorazione con acetato di uranilefissazione con paraformaldeidepreparazione della griglia per EMtrattamento a scarica luminosaadsorbimento degli esosomiessiccazione della griglia

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