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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Congelamento e montaggio muscolare
- Immergere la metà inferiore di un piccolo becher di plastica (50 mL) contenente isopentano nell'azoto liquido. L'isopentano è pronto all'uso quando diventa leggermente viscoso e forma un solido laminato bianco che riveste l'interno del becher (temperatura: -160 °C).
nota: Utilizzare sempre utensili manuali in bronzo o alluminio antiscintilla. Evitare di respirare il vapore del prodotto. Utilizzare con un'adeguata ventilazione. Se affrontare una fuoriuscita e la ventilazione è impossibile o poco pratica, indossare un respiratore adatto.
- Congela un po' di terreno di incorporamento su un mandrino (sughero) immergendolo brevemente (10 s) nell'isopentano.
- Maneggiare il muscolo (ad esempio, il tibiale o il gastrocnemio) tenendolo per il tendine, verticalmente rispetto al sughero, al fine di mantenere l'orientamento delle fibre e consentire le sezioni trasversali.
- Posizionare con cura la parte terminale del muscolo fresco sopra il mezzo di inclusione congelato.
nota: Il muscolo si attaccherà. È importante NON circondare completamente il muscolo con un mezzo di inclusione. È anche importante mantenere l'orientamento verticale per la successiva determinazione dell'area della sezione trasversale.
- Immergi il mandrino con il muscolo attaccato nel bagno di isopentano (il tempo di congelamento abituale è di 7-15 s, a seconda delle dimensioni e della composizione del campione).
nota: L'immersione nella soluzione di congelamento non deve durare più del necessario per congelare completamente il campione. Un congelamento troppo lungo fratturerà il blocco di tessuto, mentre un tempo troppo breve causerà la formazione di cristalli di ghiaccio. Un esemplare ben congelato sarà bianco gessoso.
- Dopo aver congelato il campione, mettilo in un piccolo sacchetto di plastica o in una provetta per campioni (50 ml) e conservalo immediatamente in un congelatore a -80 °C o in azoto liquido.
2. Sezionamento muscolare
- Impostare la temperatura di lavoro della camera interna del criostato a circa -23 °C.
- Lasciare acclimatare il campione (precedentemente conservato a -80 °C) alla temperatura di lavoro (un paio d'ore dovrebbero essere sufficienti).
- Tagliare più sezioni di 8 μm di spessore del campione (preferibilmente i muscoli tibiale anteriore o gastrocnemio) e raccoglierle su vetrini.
nota: Tagliare la sezione nella regione centrale del ventre del muscolo. Inoltre, per motivi di precisione, tagliare le sezioni perpendicolarmente all'asse di montaggio.
- Conservare i vetrini all'interno della camera del criostato. Non lasciarli scongelare se l'obiettivo è eseguire studi IF/IHC o colorazione enzimatica.
- Conservare i vetrini a -80 °C per ulteriori analisi.