Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Dispositivo
- Lavorare la parte principale della base del dispositivo da un blocco solido di resina acetilica ad alta densità, come descritto in questo manoscritto. A ciascuna estremità, creare strisce rialzate di 3 mm e ricavare da queste scanalature da 2,5 mm una parte per prelevare le aste (vedere la Figura 1 e la Figura 2).
- Realizzare aste in acciaio inossidabile di 2,4 mm di diametro con estremità arrotondate.
nota:Il telaio principale del coperchio è stato lavorato in lastra di duralluminio.
2. Utilizzo del dispositivo
- Sezionare l'intestino tenue e il colon dalla cavità addominale usando le forbici e le dita guantate. Rimuovere il mesentere tenendolo con una pinza curva e tirandolo delicatamente via dall'intestino.
- Sciacquare l'intestino con soluzione salina fredda tamponata con fosfato (PBS, pH 7,4) utilizzando un puntale per pipetta di tipo Gilson, che è stato tagliato all'estremità più larga in modo che possa essere inserito in una siringa di plastica da 10 o 20 mL di raccordo luer.
- Stendere l'intestino tenue (SB) su un foglio di carta assorbente e dividerlo in tre sezioni uguali di lunghezza (prossimale, medio e distale – SB1, SB2 e SB3) usando le forbici. Rimuovere il cieco e stendere il colon.
- Fai diversi tagli molto piccoli nei segmenti intestinali con le forbici per consentire al fluido di fuoriuscire e posiziona un foglio di carta assorbente sull'intestino e passa delicatamente un dito sui preparati per spremere il liquido e asciugare.
- Sollevare le sezioni e inserire le aste in acciaio inox precedentemente bagnate immergendole in un becher di soluzione salina tamponata con fosfato.
nota: L'intestino può essere capovolto se lo si desidera (capovolto).
- Etichettare un pezzo di carta o carta da filtro tagliato a misura per adattarlo alla base del dispositivo. La matita è la migliore, in quanto non è influenzata praticamente da tutte le soluzioni. Si suggerisce la data dell'autopsia, il codice sperimentale e il numero di identificazione dell'animale.
- Posizionare la carta o la carta da filtro nella base del dispositivo. Inserire le aste e l'intestino nelle fessure alla base del dispositivo. Assicurarsi che l'estremità prossimale dei segmenti sia posizionata in modo standardizzato. Le estremità prossimali devono essere vicine alle etichette delle carte.
- Posizionare la parte superiore del dispositivo sopra la base. Utilizzare le barre angolate per guidare una lama di bisturi per tagliare le sezioni longitudinalmente.
nota: Aiuta se il fazzoletto viene tenuto delicatamente e con cura con un dito per assicurarsi che non si muova con il coltello.
- Rimuovere la parte superiore del dispositivo. Rimuovere con cautela la carta da filtro e i fazzoletti (ancora sulle loro aste).
nota: Un pezzo di carta rigida posto sotto la carta da filtro aiuterà il sollevamento.
- Bagnare leggermente (con la punta del dito guantata imbevuta di PBS) i segmenti. Arrotola l'asta, da un lato all'altro, per aprire il budello e allargarlo. Il fazzoletto aderirà quindi alla carta da filtro.
- Esaminare visivamente i preparati per eventuali lesioni macroscopiche.
- Trasferire il fazzoletto aderente alla carta da filtro in un bagno poco profondo (o in una scatola per sandwich) contenente un fissativo.
nota: Dopo che il fazzoletto ha aderito alla carta da filtro o alla carta, rimarrà saldamente attaccato. Per conservare la preparazione è possibile utilizzare un'ampia gamma di fissativi. Si raccomanda di utilizzare il fluido di Carnoy per lo studio della proliferazione cellulare intestinale, che è la fissazione ideale per i migliori metodi di proliferazione cellulare; Tuttavia, la formalina o molti altri fissativi possono essere utilizzati anche se sono necessari altri endpoint.
- Dopo la fissazione (di solito 3 ore), trasferire i preparati in etanolo al 70%. I campioni possono quindi essere conservati fino al momento del bisogno. Le preparazioni possono essere studiate in presenza e/o utilizzate per la preparazione di campioni istologici per H&E o altre tecniche di colorazione istologica, immunoistochimica e/o ibridazione in situ><.
nota: La fissazione prolungata può ridurre la reattività immunoistochimica e/o la reattività all'ibridazione in situ. Le scatole per sandwich in polipropilene sono ideali per conservare un gran numero di preparazioni.
- Se necessario, i tessuti fissati dei vari segmenti intestinali possono essere trasformati in "rotoli svizzeri" e colorati con l'intera gamma di metodi istologici, compresi quelli sopra descritti. Per fare un "rotolo svizzero" i segmenti intestinali vengono rimossi dalla carta da filtro, arrotolati attorno a un bastoncino da cocktail o uno stuzzicadenti, fissati con uno spillo entomologico e lavorati per l'inclusione in cera.
- Se necessario, colorare il tessuto di massa con blu di metilene per visualizzare i focolai aberranti della cripta.
- Segna i preparativi fissi a tuo piacimento.
