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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione delle Soluzioni
- Come descritto nella Tabella 1, preparare il tampone per colon, il mezzo di separazione per densità a base di silice 100%, il mezzo di separazione per densità a base di silice 66%, il mezzo di separazione per densità a base di silice 44%, il tampone per digestione collagenasi E e il tampone FACS.
- Preparare il tampone Colon il giorno prima della procedura e conservare per una notte a 4 °C.
- Preparare il terreno di separazione per densità a base di silice al 100% il giorno prima della procedura e conservarlo per una notte a 4 °C, ponendolo a temperatura ambiente la mattina della procedura per lo scongelamento.
- Preparare i mezzi di separazione a base di silice al 66% e al 44% la mattina dell'isolamento, utilizzando i mezzi di separazione a densità 100% a base di silice a temperatura ambiente e il tampone per colon.
- Misurare la quantità appropriata di collagenasi E derivata da Clostridium histolyticum e conservare a -20 °C durante la notte prima della procedura. La mattina seguente, sciogliere nel volume appropriato di tampone colon per ottenere il tampone per la digestione della collagenasi. Per tutte le incubazioni con tampone per digestione collagenasi il giorno della procedura, preriscaldare le soluzioni a 37 °C.
- Per tutte le fasi del protocollo, mantenere una centrifuga a 20 °C e una velocità di rotazione di 859 x g, con i freni disattivati (decelerazione 0) per la centrifugazione in gradiente. Impostare un altro valore a 4 °C e una velocità di rotazione di 859 x g, con la decelerazione standard, per le fasi di lavaggio.
2. Raccolta del colon
- Eutanasia del topo tramite asfissia da CO2 seguita da un metodo di conferma approvato dall'AALAC.
- Metti il topo in posizione supina e spruzza la pelliccia con etanolo al 70%. Utilizzando grandi forbici per tessuti, praticare un'incisione verticale della linea mediana ed esporre il peritoneo intatto.
- Utilizzando le forbici per dissezione fine, aprire il peritoneo. Usa una pinza per spostare l'intestino tenue da un lato ed esporre il colon discendente. Tirare leggermente verso l'alto il colon discendente per esporre al massimo la porzione rettale del colon. Tagliare il retto distale in profondità nella pelvi e sezionare e rimuovere l'intero colon come un'unica unità, dal retto distale al cappuccio cepale.
- Trasferire il colon in 20 mL di Colon Buffer raffreddato in una provetta di polipropilene da 50 mL.
3. Pulizia dei due punti
- Posiziona il colon su un tovagliolo di carta inumidito ed estrai le feci solide applicando una leggera pressione sulla parete intestinale con l'estremità smussata di forbici o pinze.
- Metti il colon in una capsula di Petri e sciacqua l'intestino con 10 ml di Colon Buffer raffreddato utilizzando una siringa da 10 ml con un ago di riempimento smussato da 18 G.
- Trasferisci il colon su un tovagliolo di carta inumidito Colon Buffer e rimuovi il mesentere e il grasso con l'estremità affilata delle forbici.
- Mettere il colon in una capsula di Petri riempita con 5-10 ml di tampone Colon refrigerato agitando manualmente per lavare il contenuto del colon rimanente. Ripeti 2-3 volte.
- Tagliare il colon longitudinalmente dalla sua estremità rettale più muscolosa al colon prossimale (generando un singolo pezzo di colon rettangolare aperto) in una capsula di Petri riempita con Colon Buffer fresco e freddo. Eliminare i supporti esistenti e riempire con Colon Buffer pulito e freddo.
- Lavare l'intestino 3 volte facendolo roteare energicamente nella capsula di Petri e sostituendo i 5-10 ml di Colon Buffer raffreddato dopo ogni lavaggio.
- Posizionare il tessuto colon rettangolare su un tovagliolo di carta inumidito con Colon Buffer e tagliarlo affettandolo orizzontalmente e poi in piccoli frammenti (sezioni di 3 mm x 3 mm).
- Raccogliere accuratamente i frammenti del colon utilizzando una pinza fine in 20 mL di Colon Buffer raffreddato in una provetta conica in polipropilene da 50 mL.
- Lavare i frammenti del colon tre volte, ciascuna lavabile in 20 ml di tampone per colon, facendo roteare energicamente la provetta per 30 s. Tra un'agitazione e l'altra, lasciare che i frammenti di tessuto si depositino sul fondo della provetta. Decantare o aspirare sottovuoto il surnatante prevenendo la perdita di frammenti di tessuto nel processo di aspirazione tra ogni lavaggio.
nota: Non è necessario cambiare il tubo dopo ogni lavaggio.
4. Digestione della collagenasi 1
- Aggiungere 20 ml di tampone per la digestione della collagenasi ai frammenti del colon lavati nella provetta conica in polipropilene da 50 ml.
- Posizionare la provetta chiusa da 50 mL a 37 °C in un agitatore orbitale incubato con la velocità di rotazione impostata a 2 x g per 60 minuti. Assicurarsi che i frammenti di tessuto siano in costante movimento durante l'agitazione; se necessario, aumentare la velocità di rotazione in modo incrementale per assicurarsi che nessun frammento di tessuto si depositi sul fondo della provetta.
5. Preparare i gradienti dei mezzi di separazione a base di silice
- Preparare i mezzi di separazione per densità a base di silice al 66% e al 44%, utilizzando mezzi di separazione per densità a base di silice al 100% a 20 °C (temperatura ambiente) e tampone per colon.
- Versare 5 mL di terreno di separazione per densità a base di silice al 66% in ciascuna delle 3 provette separate in polipropilene da 15 mL. Preparare tre provette per colon. Questo costituisce la base a densità più elevata della procedura di isolamento del gradiente, su cui verranno stratificati i mezzi di separazione a densità inferiore per creare il gradiente di separazione.
- Conservare a 20 °C fino al momento dell'uso.
6. Raccolta del surnatante dalla digestione 1
- Raccogliere solo il surnatante utilizzando una pipetta sierologica da 25 ml e filtrare il surnatante attraverso un filtro cellulare in tessuto filtrante con pori da 40 μm inserito in una provetta conica in polipropilene pulita da 50 ml, dopo aver completato la digestione della collagenasi 1. Fare attenzione a non aspirare frammenti di tessuto esistenti.
NOTA: Conservare i frammenti di tessuto visibili rimanenti nella provetta. Questi subiranno una seconda digestione con collagenasi (fase 8).
7. Tampone per la digestione della collagenasi
- Riempire completamente la provetta in polipropilene da 50 mL con Colon Buffer.
nota: La collagenasi è attiva a 37 °C; quindi il tampone freddo inattiva questo enzima.
- Centrifugare la provetta a 4 °C a 800 x g per 5 min.
- Eliminare il surnatante tramite aspirazione a vuoto. Lavare le celle con 25 mL di Colon Buffer fresco e centrifugare a 800 x g per 5 min.
- Risospendere il pellet in meno di 1 mL di Colon Buffer fresco e refrigerato.
- Posizionare la provetta conica in polipropilene da 50 mL sul ghiaccio.
8. Digestione della collagenasi 2
- Ripetere il passaggio 4 (Digestione 1) con i frammenti di tessuto rimanenti trattenuti dal passaggio 6.1.
9. Disaggregazione dei tessuti dopo la digestione 2
- Sciacquare energicamente i frammenti di tessuto avanti e indietro tra la provetta e una siringa da 10 ml attraverso un ago smussato da 18G.
- Ripetere questo risciacquo per un minimo di 7-8 passaggi completi, continuando fino a quando non sono visibili frammenti di tessuto grossolani o detriti.
10. Filtra le celle
- Passare la sospensione di disaggregazione tissutale attraverso un filtro cellulare in tessuto filtrante con pori da 40 μm in una provetta pulita in polipropilene da 50 mL.
- Lavare il filtro delle celle in tessuto filtrante con 10 ml di tampone Colon refrigerato per recuperare le cellule intrappolate nel filtro.
11. Spegnere la digestione della collagenasi
- Riempire la provetta conica in polipropilene da 50 ml fino al bordo con Colon Buffer.
NOTA: La temperatura del tampone del colon è fondamentale per garantire l'estinzione dell'attività della collagenasi.
- Centrifuga a 4 °C e 800 x g per 5 min.
- Eliminare il surnatante tramite aspirazione a vuoto.
- Lavare risospendendo in 25 mL di Colon Buffer fresco e refrigerato, quindi centrifugare a 4 °C, 800 x g per 5 min.
- Eliminare il surnatante tramite aspirazione a vuoto.
- Raggruppare il pellet risospeso dalla digestione collagenasi 1 (fase 7) al tubo corrispondente dal passaggio 11.4.
- Ripetere il passaggio 11.4 (lavaggio e centrifugazione).
12. Separazione di densità a base di silice Separazione a gradiente di media
NOTA: Esegui i passaggi 12-13 il più rapidamente possibile per garantire un rapido spegnimento dell'attività della collagenasi.
- Seguendo il passaggio 11.7, risospendere ogni pellet in 24 mL di terreno di separazione per densità a base di silice al 44% per colon.
- Stratificare lentamente 8 mL del terreno dal passaggio 12.1 su ciascuna delle tre provette preparate al passaggio 5.2 (contenenti il 66% di terreno di separazione per densità a base di silice), utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL. Mantenere un flusso costante e lento del mezzo di separazione della densità del 44% durante la stratificazione del gradiente per evitare interruzioni dell'interfaccia.
- Bilanciare attentamente tutte le provette all'interno dei secchi della centrifuga utilizzando una bilancia o una bilancia.
- Centrifugare le provette per 20 minuti a 859 x g in una centrifuga senza freno a 20 °C. Lasciare riposare completamente i rotori prima di rimuovere le provette, facendo attenzione a non danneggiare le celle all'interfaccia del gradiente.
13. Raccogli le celle mononucleate dall'interfaccia a gradiente
- Visualizza l'interfaccia del gradiente (vicino al segno di 5 mL), dove tipicamente è presente una banda bianca spessa 1-2 mm (contenente MNC).
nota: Si può vedere o meno una banda bianca. Tuttavia, MNC si troverà su questa interfaccia e dovrebbe offuscare la chiarezza dell'interfaccia del gradiente.
- Aspirare a vuoto ed eliminare i 7 mL superiori del gradiente superiore per consentire un più facile accesso della pipetta all'interfaccia.
- Utilizzando l'aspirazione manuale continua e il movimento rotatorio costante del polso, raccogliere lo strato di interfaccia delle cellule in una provetta conica in polipropilene da 50 mL pulita. Raccogli fino a quando l'interfaccia tra i due gradienti è chiara e rifrangente (priva di celle).
- Riempire la provetta di raccolta con 50 mL di tampone FACS refrigerato. Centrifugare a 4 °C, 800 x g per 5 min.
- Aspirare il surnatante tramite aspirazione sottovuoto e risospendere il pellet in 1 mL di tampone FACS.
- Contare le cellule su un emocitometro a una diluizione 1:2 utilizzando appropriati metodi di esclusione delle cellule morte.
- Procedere alla colorazione FACS o ad altri saggi con MNC del colon appena isolata.
Tabella 1: Tabella di preparazione della soluzione
| soluzione | formula |
| Tampone per due punti | 500 mL RPMI + 10mM HEPES + 10% FBS (inattivato a calore a 56oC per 60 minuti, pH regolato a 7,3) |
| Mezzi di gradiente di densità a base di silice 100% (per due punti) | 22,5 mL di terreno a gradiente di densità a base di silice + 2,5 mL di 10x PBS. |
| Mezzi di gradiente di densità a base di silice 66% (per due punti) | 10,72 mL di terreno a gradiente di densità a base di silice 100% + 5,28 mL di tampone colon |
| Mezzi di gradiente di densità a base di silice 44% (per due punti) | 11 mL di terreno a gradiente di densità a base di silice 100% + 14 mL di tampone colon |
| Tampone per la digestione della collagenasi (per colon) | 100 U/mL di Collagenasi E da Clostridium histolyticum, disciolta in 40 mL di tampone colon |
| Tampone FACS | 500 mL 1x PBS + 5 g BSA + 1 mm EDTA + 0,2 g di sodio azide |