Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.
1. Stabilire organoidi fundici gastrici 3D di derivazione umana
NOTA: Per evitare contaminazioni, eseguire il protocollo nella sua interezza all'interno di una cappa di coltura tissutale sterile. Il tessuto fondico umano è stato raccolto da pazienti sottoposti a gastrectomia a manica.
- Raccogliere il tessuto dai pazienti sottoposti a gastrectomia a manica e metterlo nella soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbco (DPBS) ghiacciata priva di Ca2+/Mg2+ in un grande contenitore di plastica.
- Utilizzando una pinza, lavare energicamente il tessuto in un becher sterile contenente 100 mL di DPBS libero da Ca2+/Mg2+. Lavare per circa 30 s o fino a quando i detriti e il sangue non sono stati rimossi. Quindi, usando una garza sterile, rimuovere lo strato mucoso dall'epitelio.
- Usando una pinza grande, afferra saldamente lo strato muscolare del tessuto e, con forza, raschia via l'epitelio usando la grande pinza emostatica curva. Raccogli i frammenti epiteliali raschiati in una capsula di Petri sterile in polistirolo.
- Tritare il tessuto epiteliale in frammenti di circa 2,0 x 2,0 mm di2 dimensioni utilizzando rasoi per ottimizzare la digestione dei tessuti. Lavare i frammenti di tessuto con DBPS libero da Ca2+/Mg2+ integrato con antibiotici (DPBS libero da Ca2+/Mg2+, penicillina/streptomicina all'1%, 0,25 mg/mL amfotericina B/10 mg/mL gentamicina, 50 mg/mL Kanamicina), fino a quando il lavaggio non è privo di sangue. Eseguire più lavaggi se necessario. Eliminare il lavaggio filtrando accuratamente il lavaggio attraverso una garza sterile in un becher di scarto.
- Raccogliere i frammenti lavati in un pallone di vetro a fondo rotondo da 125 ml con una barra di agitazione da 25 mm e un terreno di incubazione preriscaldato (terreno basale integrato con 2 mM di L-glutammina, 1% di penicillina/streptomicina, 10 mM di tampone HEPES, 1 mg/mL di collagenasi di tipo 1, 2 mg/mL di albumina sierica bovina per colture cellulari). Sigillare il pallone a fondo tondo con setti di gomma.
- Inserire un ago spinale da 20 G nei setti e collegarlo a una bombola di ossigeno con tubo di gomma. Per filtrare eventuali contaminanti, inserire della carta velina nel tubo per creare un filtro. Attivare il deflusso dell'ossigeno al minimo. Inserire 10-15 aghi di deflusso nei setti per evitare la rottura dei setti.
- Fissare il set up a un supporto ad anello utilizzando i morsetti e metterlo in un bagno d'acqua calibrato a 37 °C con una piastra di agitazione per 30-45 minuti. Dopo che il tessuto è stato incubato per 15 minuti, rimuovere 50 μL di terreno di incubazione e controllare visivamente la presenza di ghiandole dissociate. Se le ghiandole non sono dense o non si sono separate dal tessuto, lasciare agire per altri 5-10 minuti.
- Subito dopo l'incubazione, aggiungere 50 mL di DMEM/F-12 preriscaldato al terreno di incubazione utilizzando una pipetta sierologica sterile o versando direttamente nella miscela di incubazione.
- Filtrare la miscela di ghiandole attraverso una garza sterile in quattro provette coniche da 50 mL. Tenere il filtrato in ghiaccio per 15 minuti per consentire alle ghiandole estratte di depositarsi sul fondo del tubo conico. Fare attenzione a non disturbare le ghiandole stabilizzate; rimuovere ed eliminare i 40 mL di surnatante utilizzando una pipetta sierologica. Risospendere i restanti 10 mL in 10 mL di DPBS integrato con antibiotici.
- Distribuire uniformemente la miscela in provette per colture cellulari da 5 mL. Centrifugare per 5 minuti a 65 x g a 4 °C e rimuovere con cura il surnatante utilizzando una pipetta.
nota: È fondamentale eseguire questa fase sul ghiaccio ed evitare la polimerizzazione della matrice della membrana basale durante la miscelazione. Inoltre, è importante ispezionare visivamente la densità della ghiandola mediante campionamento per 50 μl. La densità ottimale è ~70% di confluenza.
- Quindi, piastrate le ghiandole in 50 μL della matrice della membrana basale utilizzando una pipetta a punta larga. Evitare di produrre bolle durante la placcatura.
- Per consentire la polimerizzazione della matrice della membrana basale, incubare per 10-15 minuti a 37 °C. In caso di piastratura in una piastra di coltura a 12 pozzetti, aggiungere 1 mL di terreno hFGO (terreno Eagle modificato di Advanced Dulbecco/terreno F-12 integrato con 2 mM di L-glutammina, 1% di penicillina/streptomicina, 0,25 mg/mL di amfotericina B/10 mg/mL di gentamicina, 50 mg/mL di Kanamicina, 10 mM di tampone HEPES, 1 mM di n-attilcistina, 1 x N2, 1 x B27, 50% terreno condizionato con Wnt, 20% terreno condizionato con R-spondina integrato con 100 ng/mL di inibitore della proteina morfogenetica ossea, 1 nM di gastrina, 50 ng/mL di fattore di crescita epidermico, 200 ng/mL di fattore di crescita dei fibroblasti 10, 10 mM di nicotinamide e 10 μM di inibitore di Y-27632 ROCK) per pozzetto. Se non si utilizza una piastra di coltura a 12 pozzetti, aggiungere una quantità di terreno sufficiente per immergere la bolla della matrice della membrana basale.
- Coltura delle cellule a 37 °C in un incubatore per colture cellulari umidificato al 5% di CO2. Cambia i media ogni 4-5 giorni.
