Isolamento delle cripte intestinali: un metodo per isolare intere cripte dall'intestino tenue del modello murino

Abstract

Fonte: Schewe, M. et al. Il saggio di ricostituzione degli organoidi (ORA) per l'analisi funzionale delle cellule staminali e di nicchia intestinali. J. Vis. Exp. (2017)

In questo video, dimostriamo una tecnica per isolare intere cripte dall'intestino tenue di un topo. Le intere cripte isolate possono essere utilizzate per propagare organoidi 3D longevi e auto-rinnovanti in vitro.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione di Strumenti, Terreni Culturali e Piatti

1. Autoclavare in autoclave un set di forbici intestinali, forbici normali e pinze in un contenitore sterile.
2. Collocare una piastra a 96 pozzetti (fondo piatto) in un'incubatrice a 37 °C.
3. Preparare 10 mL di terreno di coltura completo con i reagenti elencati nella Tabella dei materiali.
4. Incubare il terreno completo a 37 °C a bagnomaria.
5. Scongelare la membrana basale ricostituita mettendola in un secchiello per il ghiaccio. La membrana basale ricostituita diventerà liquida a 4 °C.
6. Riempire quattro piastre di Petri con soluzione salina fredda tamponata con fosfato o PBS (4 °C).

2. Isolamento delle cripte dell'intestino tenue

1. Sacrificio per inalazione di CO₂ su un topo Lgr5-eGFP-IRES-CreER ^t2 su uno sfondo C57BL6/J. Sezionare longitudinalmente il peritoneo con un paio di forbici.
2. Afferrare lo stomaco con la pinza e tagliarlo trasversalmente a metà.
3. Usando le forbici intestinali d'ora in poi, estrarre l'intestino e metterlo in una capsula di Petri contenente PBS.
   nota: Le forbici intestinali hanno una punta affilata e smussata. La punta smussata di queste forbici ha lo scopo di non danneggiare l'architettura cripto-villo durante l'apertura dell'intestino.
4. Inizia posizionando la punta smussata nello stomaco e spingila delicatamente attraverso il piloro. Procedete tagliando con le forbici e tirando con le pinze.
5. Una volta aperto longitudinalmente tutto l'intestino tenue, lavarlo in PBS freddo tenendolo con la pinza e sciacquarlo delicatamente nella soluzione di PBS con movimenti a forma di U.
6. Una volta eliminati tutti i resti di feci, procedi ad appiattire l'intestino su un tagliere, con il lato luminale rivolto verso l'alto. Il lato luminale è facilmente riconoscibile per l'assenza di vasi sanguigni e per il suo aspetto pallido rispetto alla parte esterna.
7. Con un vetrino, rimuovere delicatamente i villi raschiando l'intestino appiattito. Eseguire questo passaggio due volte lungo l'intera lunghezza del tessuto.
8. Tagliare l'intestino tenue con una lama chirurgica sterile in pezzi di 2-5 mm.
9. Mettere i frammenti dell'intestino tenue in una provetta da 50 ml contenente 10 ml di PBS ghiacciato.
10. Pulire i frammenti di tessuto, rimuovendo le impurità residue pipettandoli su e giù nel PBS. Scartare il surnatante e ripetere questo passaggio fino a quando il PBS non è completamente chiaro.
11. Aggiungere 15 ml di PBS freddo per portare il volume finale totale di PBS a 25 ml. Aggiungere 2 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e incubare per 45 minuti su un rullo a 4 °C.
12. Scartare il PBS/EDTA.
13. Aggiungere 10 ml di PBS e staccare le cripte pipettando energicamente i frammenti di tessuto su e giù (almeno tre volte). Raccogli il surnatante.
14. Ripetere il passaggio 2.13 quattro volte. Aggiungere il terreno di coltura per raggiungere un volume finale di 50 mL.
15. Pellettare le celle mediante centrifugazione (300 x g per 5 min).
16. Risospendere il pellet in 10 mL di terreno di coltura e pellettare le cripte mediante centrifugazione (80 x g per 3 min).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM/F-12 avanzato	Thermo Fisher Scientifico	Codice 12634-010
Penicillina/Streptomicina	Thermo Fisher Scientifico	15140122	Concentrazione finale: 1%
Glutamax	Thermo Fisher Scientifico	35050061	Concentrazione finale: 10 mM
Hepes	Thermo Fisher Scientifico	15630080	Concentrazione finale: 10 mM
EGF murino ricombinante	Thermo Fisher Scientifico	PMG8041	Concentrazione finale: 50 ng/ml
Noggin murino ricombinante	Peprotech	250-38	Concentrazione finale: 100 ng/ml
Y27632	sigma	Y0503	Concentrazione finale: 10 μM
Frastagliato-1	Anaspec Bio	AS-61298	Concentrazione finale: 1 μM
R-spondina murina ricombinante	Sistemi di ricerca e sviluppo	3474-RS-050	Concentrazione finale: 1 mg/ml
B6.129P2-LGR5TM1(CRE/ERT2)CLE/J	Laboratori Jackson	Codice 8875
Tubi a basso legame	Eppendorf	Z666548-250EA