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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione di Strumenti, Terreni Culturali e Piatti
- Autoclavare in autoclave un set di forbici intestinali, forbici normali e pinze in un contenitore sterile.
- Collocare una piastra a 96 pozzetti (fondo piatto) in un'incubatrice a 37 °C.
- Preparare 10 mL di terreno di coltura completo con i reagenti elencati nella Tabella dei materiali.
- Incubare il terreno completo a 37 °C a bagnomaria.
- Scongelare la membrana basale ricostituita mettendola in un secchiello per il ghiaccio. La membrana basale ricostituita diventerà liquida a 4 °C.
- Riempire quattro piastre di Petri con soluzione salina fredda tamponata con fosfato o PBS (4 °C).
2. Isolamento delle cripte dell'intestino tenue
- Sacrificio per inalazione di CO2 su un topo Lgr5-eGFP-IRES-CreER t2 su uno sfondo C57BL6/J. Sezionare longitudinalmente il peritoneo con un paio di forbici.
- Afferrare lo stomaco con la pinza e tagliarlo trasversalmente a metà.
- Usando le forbici intestinali d'ora in poi, estrarre l'intestino e metterlo in una capsula di Petri contenente PBS.
nota: Le forbici intestinali hanno una punta affilata e smussata. La punta smussata di queste forbici ha lo scopo di non danneggiare l'architettura cripto-villo durante l'apertura dell'intestino.
- Inizia posizionando la punta smussata nello stomaco e spingila delicatamente attraverso il piloro. Procedete tagliando con le forbici e tirando con le pinze.
- Una volta aperto longitudinalmente tutto l'intestino tenue, lavarlo in PBS freddo tenendolo con la pinza e sciacquarlo delicatamente nella soluzione di PBS con movimenti a forma di U.
- Una volta eliminati tutti i resti di feci, procedi ad appiattire l'intestino su un tagliere, con il lato luminale rivolto verso l'alto. Il lato luminale è facilmente riconoscibile per l'assenza di vasi sanguigni e per il suo aspetto pallido rispetto alla parte esterna.
- Con un vetrino, rimuovere delicatamente i villi raschiando l'intestino appiattito. Eseguire questo passaggio due volte lungo l'intera lunghezza del tessuto.
- Tagliare l'intestino tenue con una lama chirurgica sterile in pezzi di 2-5 mm.
- Mettere i frammenti dell'intestino tenue in una provetta da 50 ml contenente 10 ml di PBS ghiacciato.
- Pulire i frammenti di tessuto, rimuovendo le impurità residue pipettandoli su e giù nel PBS. Scartare il surnatante e ripetere questo passaggio fino a quando il PBS non è completamente chiaro.
- Aggiungere 15 ml di PBS freddo per portare il volume finale totale di PBS a 25 ml. Aggiungere 2 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e incubare per 45 minuti su un rullo a 4 °C.
- Scartare il PBS/EDTA.
- Aggiungere 10 ml di PBS e staccare le cripte pipettando energicamente i frammenti di tessuto su e giù (almeno tre volte). Raccogli il surnatante.
- Ripetere il passaggio 2.13 quattro volte. Aggiungere il terreno di coltura per raggiungere un volume finale di 50 mL.
- Pellettare le celle mediante centrifugazione (300 x g per 5 min).
- Risospendere il pellet in 10 mL di terreno di coltura e pellettare le cripte mediante centrifugazione (80 x g per 3 min).