Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Isolamento delle colonie metastatiche
- Al 5° giorno dopo l'iniezione, rimuovere gli embrioni dall'incubatrice e ispezionare i CAM degli embrioni per verificare la distribuzione delle colonie metastatiche. Identificare gli embrioni con distribuzione uniforme delle colonie in cui sono presenti colonie compatte (o eccessivamente invasive).
nota: Il processo di coltura degli embrioni di pollo non è sterile, pertanto tutte le fasi di screening devono essere eseguite in condizioni altamente pulite per evitare future contaminazioni della coltura tissutale. La contaminazione è piuttosto rara e può essere facilmente evitata indossando guanti e mascherina e utilizzando solo strumenti sterili durante le procedure di iniezione cellulare e di isolamento delle colonie. Si consiglia di ispezionare gli embrioni uno per uno per ridurre la loro esposizione alla temperatura ambiente del laboratorio e per prevenire la contaminazione.
- Individua la colonia metastatica di interesse. Una colonia compatta può essere descritta come una con la maggior parte delle cellule tumorali situate all'interno di un'area limitata nel tessuto CAM (le cellule appaiono "raggruppate insieme"). Una colonia invasiva può essere descritta come una colonia in cui le cellule tumorali si "disperdono" nel tessuto CAM (Figura 1A, B).
NOTA: La "compattezza" della colonia metastatica può essere spiegata dall'inibizione dell'invasione delle cellule tumorali, dall'inibizione della proliferazione delle cellule tumorali o da entrambe. Occorre prestare attenzione a tutti gli scenari e isolare le colonie di contatto (Figura 1A, B). Un semplice stereomicroscopio a fluorescenza può essere utilizzato per discriminare tra fenotipi di colonie metastatiche compatte e invasive.
- Al microscopio da dissezione, tirare delicatamente verso l'alto il tessuto CAM che contiene la colonia metastatica di interesse utilizzando una pinza fine (Figura 1C).
- Tagliare il tessuto CAM che contiene la colonia metastatica usando le forbici chirurgiche.
- Trasferire il tessuto CAM che contiene la colonia metastatica in una provetta vuota e sterile da 1,5 ml (con ghiaccio) e chiudere il coperchio della provetta.
nota: Le colonie isolate possono essere mantenute sul ghiaccio per un massimo di 3 ore senza perdita di vitalità.
- Ripetere la procedura di escissione fino a quando tutte le colonie di interesse non sono raccolte in provette separate. Per evitare sofferenze agli animali, non asportare più di 2-3 colonie da un embrione. Eutanasia degli embrioni mediante congelamento a -20 °C (o altro metodo approvato) subito dopo l'escissione dalla colonia.
- Tritare delicatamente il tessuto CAM in una provetta da microcentrifuga utilizzando un ago sterile da 18G. Usa un ago separato per ogni colonia.
- Aggiungere 100 μL di soluzione di collagenasi 1x e incubare per 30 minuti a 37 °C.
- Centrifugare le cellule e il tessuto CAM a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aspirare la soluzione di collagenasi e risospendere le cellule in un terreno completo utilizzato per la linea cellulare di interesse.
nota: Normalmente, il tessuto CAM non è completamente dissociato dopo il trattamento con collagenasi e le cellule tumorali proliferano prima all'interno dei pezzi di tessuto CAM e solo successivamente migrano sul piatto di coltura tissutale.
- Centrifugare nuovamente le cellule e il tessuto CAM a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Risospendere le cellule e i pezzi di tessuto CAM in 1 mL di terreno completo più il fattore di selezione (se presente), quindi trasferirli in un singolo piatto di coltura tissutale a 12 pozzetti.
nota: I fibroblasti CAM di pollo possono persistere nella coltura tissutale per passaggi multipli, inibendo l'espansione clonale. La capacità di espandere le colonie metastatiche in presenza di un fattore di selezione (ad esempio, se un vettore che è stato utilizzato per rendere fluorescenti le cellule tumorali codifica anche un gene di resistenza agli antibiotici nei mammiferi) può accelerare notevolmente l'espansione clonale. Prima dello screening deve essere eseguito un esperimento sulla curva di uccisione per garantire che venga utilizzata la corretta concentrazione di antibiotici.
- Per le prossime 1-3 settimane, monitorare quotidianamente le cellule tumorali per la crescita e la contaminazione.
- Quando le cellule raggiungono il 70-80% della confluenza, trasferire le cellule in un piatto di coltura di volume maggiore.
nota: Si consiglia di espandere le cellule fino a congelare almeno due fiale criogeniche di ciascun clone. Il mantenimento di grandi quantità di colture tissutali può essere laborioso e non necessario.
- Procedere al sequenziamento o al successivo ciclo di selezione non appena viene raggiunto un numero sufficiente di cellule tumorali. Generalmente, 1 x 106 di cellule tumorali sono sufficienti per le moderne tecniche di sequenziamento ad alto rendimento.
- Procedere alla reiniezione del clone e all'imaging e alla quantificazione della compattezza della colonia o del contatto cellula-vaso sanguigno tumorale (Figura 2A). In alternativa, procedere al sequenziamento ad alto rendimento o ripetere la selezione della colonia.
NOTA: Per diminuire il numero di falsi positivi si consigliano almeno due turni di selezione. Due approcci sono stati impiegati con successo. 1) Espandi ogni clone e reiniettalo individualmente per confermare il fenotipo della colonia. 2) Mescolare tutti i cloni espansi in un rapporto 1:1 ciascuno, reiniettarli come miscela e ripetere il ciclo di selezione.
