Isolamento e coltura di cellule epiteliali della lingua murina: una procedura per isolare e coltivare cellule epiteliali della lingua da un modello murino

Abstract

Fonte: Prasad, M. et al. Istituzione in vitro di una linea cellulare di cancro murino della testa e del collo geneticamente modificata utilizzando un sistema virus-Cas9 adeno-associato. J. Vis. Exp. (2020)

In questo video, descriviamo l'isolamento di cellule epiteliali da una lingua murina. Queste cellule possono essere ulteriormente coltivate per dare origine a colonie cellulari.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Isolamento e coltura di cellule primarie

1. Eutanasia di un maschio o di una femmina B6 di 6 settimane; 129-GT(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J mediante asfissia da CO₂ o qualsiasi altro protocollo approvato IACUC.
   nota: Questi topi knockin CRISPR/Cas9 hanno un'espressione Cre ricombinasi dipendente dell'endonucleasi cas9 e dell'EGFP diretta da un promotore CAG. La sequenza Lox-Stop-Lox (LSL) presente nel genoma di questi topi impedisce l'espressione di Cas9 e EGFP in assenza di Cre ricombinasi. Se utilizzati in combinazione con RNA guida singola (sgRNA) e una sorgente Cre, consentono l'editing di uno o più geni di topo in vivo o ex vivo.
2. Sezionare la lingua dai topi soppressi usando le forbici chirurgiche.
3. Dissociare manualmente il tessuto tritando il tessuto della lingua in frammenti molto piccoli utilizzando un bisturi. Raccogliere i frammenti di tessuto in una provetta da 15 mL contenente 4,5 mL di terreno semplice RPMI (senza siero).
4. Aggiungere la tripla miscela enzimatica (200 μL) (vedere la Tabella 1 per la ricetta) ai frammenti di tessuto.
5. Incubare la miscela tessuto-enzima a 37 °C per 30 minuti e picchiettare la provetta ogni 10 minuti per migliorare la dissociazione enzimatica del tessuto.
6. Aggiungere il 5% di siero fetale bovino (FBS) contenente HBSS/PBS alla miscela tessuto-enzima per fermare l'azione enzimatica.
7. Filtrare la sospensione cellulare di cui sopra attraverso una rete di nylon sterile da 70 μm per separare le cellule disperse e i frammenti di tessuto più grandi.
8. Lavare la sospensione cellulare filtrata mediante centrifugazione per 300 x g per 5 minuti in HBSS/PBS a RT.
9. Risospendere il pellet nel terreno di coltura (10% FBS in RPMI/DMEM) e crescere in piastre di coltura da 60 mm fino a formare colonie cellulari distinte.
   1. Gli aggregati di cellule di coltura vengono trattenuti sulla parte superiore del filtro in una piastra di coltura da 60 mm contenente 3 mL di terreno completo (10% FBS in RPMI/DMEM) fino alla formazione di colonie cellulari.
10. Esaminare al microscopio le cellule primarie per la presenza di contaminazione da fibroblasti dopo 1 settimana di coltura. Trattare le cellule primarie sviluppate da aggregati e sospensioni cellulari con una soluzione di EDTA 0,25 tripsina 0,02% a 37 °C per 1 minuto per rimuovere i fibroblasti.
    nota: Di solito la coltura primaria da aggregati cellulari produce più colonie rispetto alle sospensioni di singole cellule. Le cellule di queste colonie forniscono una migliore efficienza di trasduzione con la trasduzione AAV.

Soluzione madre a triplo enzima 10X:
Collagenasi	1 g conc. finale [10 mg/mL]
ialuronidasi	100 mg [1 mg/mL]
DNasi	20.000 Unità conc. finale [200 mg/mL]
PBS 1X	Preparare fino a 100 ml

Tabella 1: Ricetta del tampone utilizzata in questo studio

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ceppi di topi
C57BL/6	Envigo
B6; 129-GT(ROSA)26Sortm1(CAGcas9*,-EGFP)Fezh/J	Laboratori Jackson	Codice 24857
annuire. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid)	Envigo
enzimi
Benzonase	sigma	E1014
Collagenasi IV	Thermo Fisher Scientifico	17104019
DNAsi	Thermo Fisher Scientifico	18047019
ialuronidasi	MilliporeSigma	H3506
tripsina	Industrie Biologiche Israele BeitHaemek Ltd.	03-050-1B
Terreni di coltura, prodotti chimici e reagenti
Bsa	Amresco	0332-TAM-50G
DMEM	Industrie Biologiche Israele BeitHaemek Ltd.	01-055-1A
FBS	Industrie Biologiche Israele BeitHaemek Ltd.	04-127-1A
S.b.B	sigma	H6648
Pbs	Industrie Biologiche Israele BeitHaemek Ltd.	02-023-1A
Tampone Tris	MERCK Millipore	648311-1KG
Articoli in plastica
Filtro Amicon-ULTRA 100 KDa	Millipore	UFC910024
Filtri sterili da 0,22 μm, 4 mm	Millex	SLGV004SL
Filtri sterili da 0,45 μm, 13 mm	Millex	SLHV013SL
Piastre di coltura	Greiner Bio-One
Tubi Falcon	Greiner Bio-One

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