Pretrattamento tissutale FFPE per RNA CISH: una procedura per elaborare sezioni di tessuto incluse in paraffina fissate in formalina per l'ibridazione in situ cromogenica a RNA

Abstract

Fonte: Outh-Gauer, S. et al. Ibridazione cromogenica in situ come strumento per la diagnosi del cancro della testa e del collo correlato all'HPV. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video mostra le fasi coinvolte nel pretrattamento di campioni di tessuto FFPE per l'ibridazione cromogenica in situ dell'RNA. Il processo di pretrattamento aiuta a mantenere l'integrità dell'acido nucleico all'interno delle cellule e la morfologia complessiva dei tessuti.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.

1. Preparazione dei materiali

1. Preparazione di 1x reagente per il recupero del bersaglio
   1. In un becher grande, aggiungere 70 mL di reagente di recupero target 10x (vedere la Tabella dei materiali) a 630 mL di acqua distillata.
   2. Posizionare il becher su una piastra riscaldante con un agitatore magnetico. Coprilo con un foglio di alluminio.
   3. Far bollire il contenuto a 100 °C per 10-15 min.
      NOTA: Non far bollire per più di 30 minuti.

2. Pretrattamento tissutale

NOTA: Questi passaggi seguono la raccomandazione di pretrattamento "standard" secondo le istruzioni del produttore per i campioni di testa e collo. Potrebbe essere necessario regolare la tempistica dei paragrafi 2.1 e 2.2 a seconda del tessuto manipolato.

1. Blocco dell'attività della perossidasi
   1. Aggiungere 4-6 gocce di perossido di idrogeno (vedere la Tabella dei materiali) a ciascun vetrino e incubarli per 10 minuti a temperatura ambiente.
   2. Lavare i vetrini 2 volte per 2 minuti in acqua distillata a temperatura ambiente.
2. Rottura dei legami RNA/tessuto
   1. Con un artiglio, rimuovere il foglio di alluminio dal reagente di recupero del bersaglio bollente 1x (TTR1x) posto su una piastra riscaldante e smettere di mescolare. Immergere il supporto per vetrini lentamente e con molta attenzione per 15 minuti. Coprite nuovamente il bicchiere con un foglio di alluminio.
      nota: La cottura a fuoco lento deve persistere durante questo passaggio.
      cautela: Usa l'artiglio per manipolare il foglio di alluminio e la cremagliera per vetrini per evitare ustioni. Assicurati di indossare dispositivi di protezione individuale adeguati, come guanti e camice da laboratorio.
   2. Con l'artiglio, trasferire immediatamente la griglia calda in un bagno di acqua distillata e lavarla per 2 min.
      nota: Assicurarsi che i campioni non si raffreddino nel TTR1x.
   3. Lavare i vetrini in etanolo fresco al 100% per 2 minuti.
   4. Lasciare asciugare i vetrini a temperatura ambiente per 2 minuti.
3. Creazione di barriere
   1. Con una penna barriera idrofobica (vedere la Tabella dei materiali), disegnare una barriera attorno al campione. Lasciare asciugare per almeno 5 min.
      nota: Lascia che la barriera si asciughi davvero. Se si consuma durante la procedura, non esitare a disegnarlo di nuovo. Evitare di toccare il fazzoletto con la penna. Il protocollo può essere messo in pausa durante la notte qui.
4. Digestione della proteasi
   1. Posizionare i vetrini sul rack dei vetrini e aggiungere ~4 gocce di Protease Plus per campione (vedere la Tabella dei materiali).
   2. Coprire la vaschetta di controllo dell'umidità con un coperchio e inserirla nel forno di ibridazione per 30 minuti a 40 °C.
      nota: Per evitare l'evaporazione, assicurarsi che la manopola sia completamente ruotata in posizione di blocco.
   3. Togliere la teglia dal forno e rimuovere la griglia scorrevole.
   4. Un vetrino alla volta, rimuovere rapidamente il liquido in eccesso e posizionare il vetrino in una griglia per vetrini immersa in una vaschetta per colorare riempita con acqua distillata.
   5. Lavare i vetrini 2 volte per 2 minuti in acqua distillata a temperatura ambiente. Agitare costantemente.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Forno HybEZ (110v)	Diagnostica cellulare avanzata Inc.	Codice 321710
Scaffale per vetrini HybEZ	Diagnostica cellulare avanzata Inc.	300104
Penna barriera idrofobica ImmEdge	Diagnostica cellulare avanzata Inc.	310018
RNAscope H202 e reagente Protease Plus	Diagnostica cellulare avanzata Inc.	Codice 322330	Perossido di idrogeno x2 e proteasi Plus x 1
Reagenti per il recupero del bersaglio dell'RNAscope	Diagnostica cellulare avanzata Inc.	Codice 322000