Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.
1. Esecuzione del test
NOTA: Non lasciare che le sezioni si asciughino tra le fasi di incubazione.
- Ibridazione della sonda HPV
NOTA: Assicurarsi che le sonde siano preriscaldate per sciogliere eventuali precipitazioni prima dell'uso. Per questa fase, al posto della sonda HPV, può essere utilizzata anche la peptidil-prolil isomerasi B (PPIB) per il controllo positivo o la diidrodipicolinato reduttasi (DAPB) per il controllo negativo (vedere la Tabella dei materiali).
- Toccare e/o scorrere i vetrini per rimuovere il liquido in eccesso e posizionarli nel rack dei vetrini. Aggiungere ~4 gocce di sonda HPV per coprire completamente ogni sezione.
- Coprite la teglia con un coperchio e inseritela nel forno per 2 h a 40 °C.
NOTA: Per evitare l'evaporazione, assicurarsi che la manopola sia completamente ruotata in posizione di blocco.
- Togliere la teglia dal forno e rimuovere la griglia scorrevole.
- Un vetrino alla volta, rimuovere rapidamente il liquido in eccesso e posizionare il vetrino in un rack per vetrini immerso in una piastra per la colorazione riempita con 1x tampone di lavaggio.
- Lavare i vetrini in 1 tampone di lavaggio per 2 minuti a temperatura ambiente agitando costantemente. Ripetere l'operazione con 1 tampone di lavaggio fresco.
- Ibridazione di AMP1, AMP2, AMP3 e AMP4
NOTA: Questi passaggi includono l'ibridazione nel forno di ibridazione e AMP1–AMP4 dal kit acquistato (vedere la Tabella dei materiali).
- Toccare e/o scorrere per rimuovere il liquido in eccesso dai vetrini e posizionarli nel rack per vetrini. Aggiungi ~4 gocce di AMP1 per coprire completamente ogni sezione.
- Coprite la teglia con un coperchio e inseritela nel forno per 30 minuti a 40 °C.
- Togliere la teglia dal forno e rimuovere la griglia scorrevole.
- Un vetrino alla volta, rimuovere rapidamente il liquido in eccesso e posizionare il vetrino in un rack per vetrini immerso in una piastra per la colorazione riempita con 1x tampone di lavaggio.
- Lavare i vetrini in 1 tampone di lavaggio per 2 minuti a temperatura ambiente agitando costantemente. Ripetere l'operazione con 1 tampone di lavaggio fresco.
- Ripetere i passaggi 1.2.1–1.2.5, ma utilizzare ~4 gocce di AMP2 invece di AMP1 e incubare per 15 minuti a 40 °C. Lavare i vetrini 2 volte per 2 minuti, entrambe le volte in tampone di lavaggio fresco.
- Ripetere i passaggi 1.2.1–1.2.5, ma utilizzare ~4 gocce di AMP3 invece di AMP1 e incubare per 30 minuti a 40 °C. Lavare i vetrini 2 volte per 2 minuti, entrambe le volte in tampone di lavaggio fresco.
- Ripetere i passaggi da 1.2.1 a 1.2.5, ma utilizzare ~4 gocce di AMP4 invece di AMP1 e incubare per 15 minuti a 40 °C. Lavare i vetrini 2 volte per 2 minuti, entrambe le volte in tampone di lavaggio fresco.
- Ibridazione di AMP5 e AMP6
NOTA: Questi passaggi non includono l'ibridazione in forno ma l'ibridazione a temperatura ambiente. AMP5 e AMP6 provengono dal kit acquistato (vedi Tabella dei Materiali).
- Toccare e/o scorrere i vetrini per rimuovere il liquido in eccesso e posizionarli nel rack dei vetrini. Aggiungi ~4 gocce di AMP5 per coprire completamente ogni sezione.
- Coprire la teglia con un coperchio e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Un vetrino alla volta, rimuovere rapidamente il liquido in eccesso e posizionarlo in una griglia per vetrini immersa in una vaschetta per colorare riempita con 1x tampone di lavaggio.
- Lavare i vetrini in 1 tampone di lavaggio per 2 minuti a temperatura ambiente agitando costantemente. Ripetere l'operazione con 1 tampone di lavaggio fresco.
- Ripetere i passaggi 1.3.1–1.3.4, ma utilizzare ~4 gocce di AMP6 invece di AMP5 e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Lavare i vetrini 2 volte per 2 minuti, entrambe le volte in tampone di lavaggio fresco.
