1. Preparazione dei reagenti di controcolorazione
- Preparare il 50% di ematossilina.
- In una cappa aspirante, aggiungere 100 mL di ematossilina I di Gill (vedere la Tabella dei Materiali) a 100 mL di acqua distillata in una capsula di colorazione.
nota: La soluzione colorante con ematossilina al 50% può essere riutilizzata per un massimo di 1 settimana.
- Preparare acqua ammoniacale allo 0,02% (p/v) (reagente azzurrante).
- Nella cappa aspirante, aggiungere 1,43 mL di idrossido di ammonio 1 N a 250 mL di acqua distillata in un cilindro graduato o in un altro contenitore. Sigillare il cilindro con pellicola di paraffina. Mescola bene il suo contenuto per 3x-5x.
nota: Per la quantificazione dei saggi, è fondamentale utilizzare l'idrossido di ammonio. I reagenti possono essere preparati in anticipo. Assicurarsi che tutti i contenitori rimangano coperti.
2. Rilevamento del segnale con 3,3'-diaminobenzidina
ATTENZIONE: La diaminobenzidina (DAB) è tossica. Seguire le precauzioni appropriate e le linee guida di sicurezza durante lo smaltimento e la manipolazione di questa sostanza chimica.
- Miscelare volumi uguali di DAB-A e DAB-B (vedere la Tabella dei materiali) in un tubo di dimensioni adeguate erogando lo stesso numero di gocce di ciascuna soluzione. Produrre ~120 μl di substrato DAB per sezione (~2 gocce di ciascun reagente/totale di 4). Mescola bene per 3x–5x.
- Prelevare ogni vetrino, uno alla volta, dal rack per vetrini e picchiettare e/o scorrere per rimuovere il liquido in eccesso prima di inserirlo nel rack per vetrini.
- Pipettare ~120 μL di DAB su ciascuna sezione di tessuto. Assicurarsi che le sezioni siano coperte e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Smaltire il DAB rimanente secondo le normative locali e inserire il vetrino in un rack per vetrini immerso in una capsula colorante riempita con acqua di rubinetto.
3. Colorazione
- Spostare il rack per vetrini in una capsula contenente il 50% di soluzione colorante di ematossilina, lasciarlo riposare per 30 secondi a temperatura ambiente. Si noti che le diapositive diventeranno viola.
- Ritrasferire immediatamente il rack per vetrini in una vaschetta per la colorazione contenente acqua di rubinetto e lavare i vetrini 3x-5x muovendo il rack su e giù.
- Continuare a ripetere la fase di lavaggio con acqua di rubinetto fresca fino a quando le guide non sono libere mentre le sezioni rimangono viola.
- Sostituire l'acqua del rubinetto nella vaschetta di colorazione con acqua di ammoniaca allo 0,02%. Spostare il rack su e giù 2x–3x. Si noti che la sezione di tessuto dovrebbe diventare blu.
- Sostituire l'acqua di ammoniaca con acqua di rubinetto. Lavare i vetrini 3-5 volte.
4. Disidratazione
- Spostare la griglia per vetrini in una vaschetta per la colorazione contenente il 70% di etanolo nella cappa aspirante e lasciarla riposare per 2 minuti agitando di tanto in tanto.
- Spostare la griglia per vetrini in una prima vaschetta per colorare contenente etanolo al 100% e lasciarla riposare per 2 minuti agitando di tanto in tanto.
- Spostare la griglia per vetrini in una seconda vaschetta per la colorazione contenente etanolo al 100% e lasciarla riposare per 2 minuti agitando di tanto in tanto.
- Spostare la griglia per vetrini in una capsula per colorare contenente xilene e lasciarla riposare per 5 minuti agitando di tanto in tanto.
5. Montaggio su slitta
- Rimuovere le guide dalla griglia delle diapositive e appoggiarle in piano, con le sezioni rivolte verso l'alto nella cappa aspirante.
- Monta un vetrino alla volta aggiungendo 1 goccia di un mezzo di montaggio a base di xilene a ciascun vetrino e posizionando con cura un vetrino coprioggetti da 24 mm x 50 mm sulla sezione. Evitare di intrappolare bolle d'aria.
- Asciugare le diapositive all'aria per ≥5 min.
6. Valutazione del campione
- Esaminare le sezioni di tessuto con un microscopio a campo chiaro standard con un ingrandimento di 20x-40x.
