Raccolta di DRG dalla colonna vertebrale del ratto: una procedura per estrarre il ganglio della radice dorsale dalla colonna vertebrale di un modello di ratto

In questo articolo

Abstract

Fonte: Schmidt, L. B. et al. Il modello in vivo della membrana corioallantoica del pulcino per valutare l'invasione perineurale nel cancro della testa e del collo. J. Vis. Exp. (2019)

In questo video, dimostriamo l'estrazione del ganglio della radice dorsale o DRG da una spina dorsale di ratto raccolta per applicazioni a valle.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Raccolta e preparazione dei DRG (tempo stimato: 2 h, giorno 8)

NOTA: Gli esperimenti con topi e ratti richiedono l'approvazione dell'IACUC. In alcuni paesi, anche l'uso di uova di gallina richiede l'approvazione.

Prendi ratti Sprague Dawley di sei o sette settimane (~200 g di peso) per estrarre DRG.
nota: Un ratto dovrebbe produrre ~40 DRG cervicali e toracici. Anche il DRG del topo si integra nel CAM; Tuttavia, le condizioni per questa specie devono essere ottimizzate in modo indipendente.
In una cappa a flusso laminare, raccogliere i DRG dalle regioni cervicali e toraciche seguendo il protocollo per l'estrazione dei DRG nel topo pubblicato altrove. Seguire la Figura 1 per orientarsi su come raccogliere i DRG.
1. Eutanasia del ratto mediante puntura cardiaca dopo somministrazione di Ketamina/Xilazina iniettata per via intraperitoneale. Pulisci la pelle del ratto con etanolo al 70% e rimuovi la spina dorsale del ratto usando una forbice. Non eseguire la lussazione cervicale perché ciò danneggerebbe i DRG cervicali.
2. Separare le regioni cervicale, toracica e lombare con la stessa forbice, seguendo la rappresentazione anatomica schematica e le immagini grossolane fornite nella Figura 1A-D. Posizionare le sezioni della colonna vertebrale in un piatto di coltura da 10 cm con 1X PBS per mantenere i tessuti bagnati.
3. Con una delicata forbice ossea, aprire le ossa vertebrali nella parte dorsale e ventrale, separando la colonna vertebrale in due metà laterali (Figura 1E-F). Posizionare le sezioni di tessuto in un piatto pulito di 10 cm con 1X PBS fresco.
4. Usando una pinza, staccare delicatamente il midollo spinale dalle ossa vertebrali per visualizzare i DRG (Figura 1G).
5. Con una pinza sottile tenuta sotto ogni DRG, afferralo ed estrailo dalla cavità ossea in cui è alloggiato. Non tenere direttamente il DRG perché ciò causerebbe danni ai tessuti. Non tagliare i fasci di assoni dal DRG (Figura 1H).
  nota: Evitare l'uso di DRG lombari poiché hanno una ridotta integrazione nel CAM. Per la posizione della regione DRG, seguire l'illustrazione schematica e le immagini anatomiche grossolane nella Figura 1A-D.
Immediatamente dopo la raccolta, immergere ciascun DRG in un terreno di coltura DMEM integrato con il 2% di penicillina/streptomicina (Pen/Streptomic) e il 10% di siero fetale bovino (FBS) inattivato a caldo per aiutare a prevenire la contaminazione batterica dei DRG. Raggruppare tutti i DRG nella stessa piastra di coltura da 6 cm con 4 ml di terreno di coltura.
Dopo aver raccolto tutti i DRG, trasferirli in una nuova piastra di coltura con terreno di coltura DMEM integrato con il 2% di Pen/Strep più il 10% di FBS e contenente 1,25 μg/mL di colorante fluorescente rosso. Incubare per 1 ora nell'incubatore per colture cellulari.

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Risultati

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Figura 1: Estrazione DRG il giorno 8. A. Schema del ratto che illustra la posizione anatomica della colonna vertebrale. B. Diagramma della configurazione delle vertebre di ratto che mostra diverse regioni del corpo; verde per la cervicale, blu scuro per la toracica, arancione per la zona lombare e azzurro per le vertebre sacrali. C-D. Asp...