Modello di membrana corioallantoidea di pollo o tumore CAM: un metodo in ovo per simulare l'invasione perineurale delle cellule tumorali

Abstract

Fonte: Schmidt, L. B. et al. Il modello in vivo della membrana corioallantoica del pulcino per valutare l'invasione perineurale nel cancro della testa e del collo. J. Vis. Exp. (2019)

In questo video, descriviamo il metodo per co-coltivare i gangli della radice dorsale e le cellule tumorali sulla membrana corioallantoica del pulcino o CAM per studiare l'invasione perineurale.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Innesto DRG sul CAM (tempo stimato: 40 min, giorno 8)

1. Preparare una piastra di coltura di 6 cm con terreno HBSS per lavare i DRG prima dell'impianto. Portare gli ovuli preparati nella camera a flusso laminare per colture cellulari. Rimuovere la membrana di paraffina dall'uovo (Figura 1A).
2. Con una pinza sterile fine, afferrare delicatamente un DRG dall'interno del terreno di coltura. Immergilo nel mezzo HBSS per rimuovere il mezzo in eccesso che contiene il colorante fluorescente. Tenere il DRG molto delicatamente; in caso contrario, si attaccherà al forcipe.
3. Posizionare il DRG sulla camma, facendo attenzione a non forare la membrana (Figura 1B-C). Se necessario, utilizzare un altro paio di pinze per aiutare a staccare il DRG dalla punta della pinza quando lo si posiziona sulla CAM.
   nota: Mantenere il DRG bagnato con il mezzo HBSS faciliterà anche il distacco dalla pinza.
4. Coprire l'uovo con una medicazione sterile a pellicola trasparente. Coprire tutte le finestre e le forature praticate nel guscio dell'uovo per evitare la contaminazione batterica (Figura 1D).
5. Dopo aver innestato i DRG in tutte le uova, incubare le uova in un'incubatrice umidificatrice a 38 °C e 54% di umidità per 2 giorni, senza rotazione.

2. Innesto di cellule tumorali sul CAM (tempo stimato: 1 ora e 30 minuti, giorno 10)

1. A 48 ore prima di innestare le cellule, placcare le cellule necessarie in piastre di coltura. Calcolare da 0,5 a 1 x 10⁶ cellule per uovo per le cellule UM-SCC-1 al fine di generare tumori tridimensionali nella CAM. Tieni presente che il numero di cellulare può variare in base alla linea cellulare.
2. Aspirare il terreno e aggiungere il terreno di coltura DMEM integrato con l'1% di Pen/Streptococco più il 10% di FBS e 2,5 μg/mL di colorante fluorescente verde. Incubare per 1 ora a 37 °C nell'incubatore per colture cellulari. Quindi, controllare l'intensità della fluorescenza al microscopio, aspirare il terreno, lavare una volta con 1X PBS e aggiungere lo 0,25% di tripsina per un massimo di 10 minuti. Neutralizzare la tripsina con il terreno integrato con DMEM.
3. Centrifugare a 250 x g per 4 minuti fino a formare un pellet di cellule. Aspirare il terreno DMEM e risospendere in HBSS per lavare il colorante fluorescente in eccesso. Contare le cellule utilizzando un emocitometro.
4. Portare gli ovuli nella camera a flusso laminare per colture cellulari. Con forbici e pinze, aprire la medicazione in pellicola trasparente che copre l'uovo (Figura 1E-F).
5. Centrifugare nuovamente il numero calcolato di cellule, aspirare il terreno HBSS e risospendere a una concentrazione finale compresa tra 0,5 e 1 x 10⁶ cellule per 5 μl dello stesso mezzo (Figura 1G). Preparare la quantità necessaria per il numero totale di uova (5 μl di sospensione cellulare per uovo).
6. Porre 5 μl di soluzione cellulare sul CAM, a circa 2 mm dal DRG (Figura 1H). Mantenere distanze uniformi tra il DRG e le celle. Fai molta attenzione a non disturbare l'uovo per ridurre al minimo la diffusione delle cellule.
   nota: Per avviare l'impianto cellulare, scegliere ovuli su cui la superficie CAM sia visivamente asciutta. Se la superficie è troppo umida, le cellule possono diffondersi e non formare tumori regolari.
7. Coprire l'uovo con una nuova pellicola come al punto 1.4. Innestare le cellule in tutti gli ovuli. Incubare le uova in un'incubatrice umidificatrice a 38 °C e 54% di umidità per 7 giorni, senza rotazione.

Risultati

Figura 1: Innesto di DRG, cellule e raccolta di CAM: Il giorno 8: A. CAM facilmente osservabile dopo la rimozione della membrana di cera di paraffina. B-C. Con una pinza fine, il DRG viene posizionato sulla CAM. D. L'uovo viene coperto con pellicola e messo nell'incubatrice; Le frecce indicano le aperture coperte. Il giorno 10: E-...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Incubatrice per uova	GQF Sportivo Digitale	#1502	Incubatrice per uova dotata di termostato digitale rotatore automatico, controlli di temperatura e umidità
Taglierina per incisione	DREMEL	#108	Usato per forare il guscio dell'uovo
Pinza Graefe extra fine, curva	Strumenti per la scienza fine (FST)	#11151-10	Utilizzato per innestare DRG sul CAM il giorno 8 e per prelevare il tessuto CAM il giorno 17
Pinza Graefe extra fine, dritta	Strumenti per la scienza fine (FST)	#11150-10	Utilizzato per innestare DRG sul CAM il giorno 8 e per raccogliere il tessuto CAM il giorno 17
Uova fecondate di Livorno Bianco Lohmann			Ovuli fecondati nei primi giorni di fecondazione, preferibilmente il primo giorno dopo la fecondazione. Le uova utilizzate in questo protocollo provengono dalla Michigan State University Poultry Farm.
Pinze filtranti	EMD Millipore	#XX6200006P	Pinze smussate utilizzate per rimuovere il guscio dell'uovo
HBSS (1x)	Gibco	#14025-092	La soluzione salina bilanciata di Hank
Membrana in cera di paraffina	Pellicola da laboratorio Parafilm	#PM-996	Utilizzato per coprire temporaneamente le aperture delle uova fino all'innesto DRG del giorno 8
PBS (1x) pH 7,4	Gibco	#10010-023	Soluzione salina tamponata con fosfato
Tegaderm Medicazione in film trasparente	3M	#9505W	Sterile, 6x7cm utilizzato per coprire le aperture delle uova durante l'incubazione