Modellazione del trattamento intratumorale con inibitori dei miRNA: un metodo per analizzare l'effetto degli inibitori dei miRNA sulla crescita tumorale nel modello murino

Abstract

Fonte: Ramirez-Moya, J. et al. Inibizione in vivo del microRNA per diminuire la crescita tumorale nei topi. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video dimostra la somministrazione in vivo di inibitori di miRNA come agenti terapeutici contro la crescita tumorale in modelli murini ortotopici. La somministrazione intratumorale di inibitori sintetici dei miRNA o antagomi consente loro di legarsi e inibire i miRNA endogeni, causando così la sovraregolazione dell'mRNA e la soppressione della crescita tumorale.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Inoculazione delle cellule sul fianco e trattamento degli antagomi intratumorali

1. Preparazione delle cellule
   1. Ingegnerizzare una linea cellulare di carcinoma tiroideo umano Cal62 (mutazioni KRASG12R e p53A161D) per sovraesprimere un costrutto transgenico che esprime costitutivamente GFP e luciferasi (CMV-Firefly Luc-IRES-eGFP). Selezionare le cellule transgeniche in base alla resistenza agli antibiotici o selezionando le cellule GFP-positive con citometria a flusso.
   2. Coltivare le cellule nel terreno di Eagle's modificato (DMEM) di Dulbecco integrato con penicillina, streptomicina e siero fetale bovino (FBS) al 10% a 37 °C e CO₂ al 5%.
   3. Sospendere 1 x 10⁶ celle in 50 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a 4 °C.
2. Inoculazione cellulare nei fianchi dei topi
   1. Mescolare le cellule con la stessa quantità di matrice della membrana basale. Ad esempio, aggiungere 1 x 10⁶ celle in 50 μL di PBS a 50 μL di matrice della membrana basale (vedere Tabella dei materiali) e mescolare delicatamente.
   2. Iniettare 100 μL del campione (cellule in PBS + matrice della membrana basale) per via sottocutanea nel fianco sinistro di topi immunodeficienti BALB/c nu/nu di 6 settimane utilizzando una siringa da insulina da 1 mL con un ago da 27G 1/2'' (0,4x13 mm).
3. Trattamento degli antagomi intratumorali
   1. Sospendere l'antagomiR (vedi Tabella dei materiali) o il controllo negativo in 500 μL di acqua distillata priva di RNasi.
   2. Prima dell'iniezione, preparare 2 nmol dell'antagomiR o del controllo insieme a un reagente di somministrazione in vivo (vedere la Tabella dei Materiali) per ogni iniezione.
      1. Miscelare prima la soluzione di antagomiR (vedere Tabella dei materiali) e il tampone di complessazione (vedere Tabella dei materiali) in un rapporto 1:1. Ad esempio, aggiungere 80 μL di soluzione di miRNA-inibitore (16 nmol) a 80 μL di tampone di complessazione (incluso nel kit di reagenti per la somministrazione in vivo, vedere la Tabella dei materiali).
      2. Portare il reagente di erogazione in vivo a temperatura ambiente. Aggiungere 160 μl a una provetta da 1,5 mL e aggiungere immediatamente 160 μl di soluzione di antagomiR diluita. Riportare il reagente rimanente a -20 °C. Se necessario, conservare il reagente a 4 °C per un massimo di una settimana dopo lo scongelamento.
      3. Vortice immediatamente (10 s) per garantire la complessazione del reagente-antagomiR di somministrazione in vivo.
      4. Incubare la miscela in vivo di reagente-antagomiR per 30 minuti a 50 °C. Centrifugare brevemente la provetta per recuperare il campione.
      5. Diluire il complesso 6 volte aggiungendo 1360 μL di PBS pH 7.4 e mescolare bene.
      6. Procedere con la somministrazione in vivo del complesso reagente-antagomiR (8 topi/condizione) o conservare il complesso a 4 °C per un massimo di una settimana prima dell'iniezione. Iniettare 200 μL per via intratumorale in ciascun tumore (2 nmol di antagomiR).
         NOTA: Il volume e la quantità dell'antagomiR sono indipendenti dal volume del tumore.
   3. Eseguire il trattamento 3 volte a settimana (lunedì, mercoledì e venerdì) per 2 settimane.
4. Analisi della crescita tumorale
   1. Iniettare 50 μL di una soluzione da 40 mg/mL di substrato di D-luciferina (vedere Tabella dei materiali) per via sottocutanea in ogni momento con una siringa da 1 ml con un ago da 27 G 1/2" (0,4 mm x 13 mm).
      1. A 8 minuti dall'iniezione, anestetizzare i topi utilizzando isoflurano al 3% miscelato con ossigeno. Valutare il livello di anestesia mediante il riflesso del pedale (pizzicamento deciso del dito) e regolare l'erogazione dell'anestetico in modo appropriato per mantenere il piano chirurgico.
      2. Applicare un unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire l'essiccazione.
5. Immagine del segnale bioluminescente con il software di imaging in vivo (vedi Tabella dei materiali).
   NOTA: I calibri possono essere utilizzati anche per misurare il volume e la crescita del tumore.
6. Una volta ottenuti i segnali di bioluminescenza, analizzare la crescita tumorale confrontando entrambi i trattamenti e determinarne il significato utilizzando un t-test. Per analizzare la varianza all'interno del gruppo, utilizzare il SEM.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Matrice della membrana basale: Matrice della membrana basale Matrigel ad alta concentrazione	Corning	#354248
AntagomiR: inibitore del miRNA mirVana	Thermo Fisher	4464088	Pronto per l'uso in vivo
Reagente di somministrazione in vivo: Reagente Invivofectamine 3.0	Thermo Fisher	FIV 3005
Controllo negativo: mirVana miRNA Inibitore, Controllo Negativo #1	Thermo Fisher	4464077	Pronto per l'uso in vivo
XenoLight D-Luciferin - Substrato bioluminescente al sale K+	PerkinElmer	122799	Diluito in PBS
Software di imaging in vivo: IVISLumina II Imaging System	Calibro per le scienze della vita