Inoculazione ortotopica di cellule tumorali tiroidee nella tiroide murina: una procedura per stabilire un modello murino di carcinoma tiroideo ortotopico

Abstract

Fonte: Julia Ramirez-Moya, et al. Inibizione in vivo del microRNA per ridurre la crescita tumorale nei topi. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video descrive la procedura per l'inoculazione ortotopica di cellule tumorali tiroidee nella ghiandola tiroidea di modelli murini, che possono quindi fungere da preziosa piattaforma per valutare la cancerogenesi e scoprire potenziali strategie di trattamento.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Inoculazione ortotopica delle cellule nella tiroide

1. Preparazione delle cellule
   1. Ingegnerizzare una linea cellulare di carcinoma tiroideo umano Cal62 per sovraesprimere un costrutto transgenico che esprime costitutivamente GFP e luciferasi. Selezionare le cellule transgeniche in base alla resistenza agli antibiotici o selezionando le cellule GFP-positive con citometria a flusso.
   2. Far crescere queste cellule in DMEM integrato con antibiotici (penicillina e streptomicina) e FBS al 10% a 37 °C e CO₂ al 5%.
   3. Sospendere 1 x 10⁵ celle in 5 μL di PBS.
2. Inoculazione cellulare nella ghiandola tiroidea dei topi
   1. Iniettare 100 μL di analgesico (buprenorfina) e 100 μL di antibiotico (cefalosporina) per via sottocutanea in topi BALB/c nu/nu di 7 settimane. Disinfettare il sito di iniezione con alcol.
   2. Iniettare 5 μL della soluzione cellulare nella ghiandola tiroidea dei topi.
      1. Anestetizzare il topo utilizzando isoflurano al 3% miscelato con ossigeno e posizionarlo sotto uno stereomicroscopio in una cappa a flusso sterile. Valutare il livello di anestesia mediante il riflesso del pedale (pizzicamento deciso del dito) e regolare l'erogazione dell'anestetico in modo appropriato per mantenere il piano chirurgico.
      2. Applicare un unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire l'essiccazione.
      3. Per ogni topo, disinfettare il collo con iodopovidone e praticare un'incisione di circa 2 cm nella pelle con le forbici. Una volta aperto, esporre il collo spostando le ghiandole salivari.
      4. Sezionare i muscoli della cinghia usando una pinza da dissezione e/o le forbici per esporre la trachea e la ghiandola tiroidea. Utilizzando una siringa da 10 μl, iniettare 5 μl della soluzione cellulare nel lobulo tiroideo destro, situato a lato della cartilagine cricoidea.
      5. Riposizionare le ghiandole salivari e suturare l'incisione con la seta utilizzando suture intrecciate, rivestite e non assorbibili.
      6. Aggiungere iodopovidone all'area della ferita e posizionare il topo su una coperta termica mentre si riprende dall'anestesia.
   3. Il giorno seguente dopo l'intervento, iniettare per via sottocutanea un analgesico (buprenorfina) e aggiungere 3 ml di ibuprofene liquido (40 mg/mL) in 250 ml di acqua potabile per 1 settimana.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Matrice della membrana basale: Matrice della membrana basale Matrigel ad alta concentrazione	Corning	#354248
Reagente di somministrazione in vivo: Reagente Invivofectamine 3.0	Thermo Fisher	IVF3005
Software di imaging in vivo: IVIS-Lumina II Imaging System	Calibro per le scienze della vita